Rekombinantes ß-Lactoglobulin durch Präzisionsfermentation

Durch den weltweit steigenden Bedarf an tierischem Protein gewinnt die mikrobielle Produktion funktioneller Lebensmittelinhaltsstoffe (Präzisionsfermentation) an Bedeutung. Das Molkenprotein ß-Lactoglobulin (BLG) besitzt zwei konservierte Disulfidbrücken und eine freie Thiol-Gruppe und dient als Modellprotein für Struktur-Funktions-Studien. Nach saurer Hydrolyse und Erhitzen kann BLG Nanofibrillen bilden, die als biologisch abbaubare Biomaterialien oder in der Lebensmittelindustrie interessant sind. In dieser Arbeit wurden mithilfe gezielter Mutagenese BLG-Varianten ohne freie Thiol-Gruppe (rBLG-SH), ohne äußere Disulfidbrücke (rBLG-SS) und ohne Cysteine (rBLG-C) rekombinant mit Escherichia coli produziert und anschließend gereinigt. rBLG-SH und rBLG-SS wurden in löslicher Form mit finalen Konzentrationen von 60-160 mg L-1 gewonnen, während rBLG-C aus Inclusion bodies rückgefaltet werden musste, was finale Konzentrationen von bis zu 400 mg L-1 ergab. Die Veränderungen der Aminosäuresequenz beeinflussten sowohl die Struktur, das Dimerisierungsverhalten als auch die Fibrillenbildung der BLG-Varianten. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der rekombinanten Produktion N-terminaler BLG-Peptide (AS 1-53), die als Bausteine amyloider Fibrillen dienen. Zur Erhöhung der finalen Konzentration wurde die Produktion eines unlöslichen Peptid-Fusionsproteins in zwei Fed-Batch-Kultivierungen mit unterschiedlichen Feeding-Strategien verglichen, wobei die höchsten Biomasse- und Inclusion body-Konzentrationen mit der pH-stat-Methode erzielt wurden, deren Substratzugabe auf einer indirekten Feedback-Kontrolle basiert. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde rBLG mit Protease-defizienten und genomreduzierten Bacillus subtilis-Stämmen sekretiert. Dank ihrer veränderten Oxidationskraft konnten die genomreduzierten Stämme Disulfidbrücken effizienter ausbilden, was zur verbesserten rBLG-Produktion beitrug. Erstmals wurden so mit einem Gram-positiven Organismus rBLG-Konzentrationen von 60-70 mg L-1 erzielt.