Epigenetische Veränderung der akuten lymphatischen Leukämie: Untersuchung der DNA-Methylierung zellzyklus- und differenzierungsrelevanter Gene als mögliche Prognosefaktoren mittels Pyrosequenzierung

Textprobe:

Kapitel 4.3.9, Pyrosequenzierung:

Prinzip:

Während mit MSP zunächst qualitativ festgestellt werden kann, ob eine Methylierung im Bereich der untersuchten DNA-Sequenz vorliegt ('Ja-Nein-Entscheidung'), ist es mit der seit kurzem verfügbaren Pyrosequencing-Technik möglich, das Ausmaß an Methylierung quantitativ zu bestimmen. Dies ist insbesondere dann wichtig, wenn es zu einer allelo-spezifischen Methylierung während der Differenzierung kommt. Für ausgewählte Gene erfolgt deshalb die Quantifizierung der Methylierung mittels Pyrosequenzierung. Die erforderlichen Primer werden mit Hilfe der 'Assay-Design-Software' (welche in das Pyrosequenzierungs-System integriert ist) erstellt. Die Pyrosequenz-Reaktionen werden nach Standard-Protokollen (www.biotage.com) mit dem Pyro-Gold Mastermix durchgeführt (Dupont, Tost et al. 2004).
Durchführung:

Für die Durchführung der Pyrosequenzierung muß die Reagienzenkammer des Gerätes manuell bestückt werden. Das Gerät berechnet aus der Zahl der Proben und dem Nukleotidgehalt der zu untersuchenden Sequenz den Bedarf an Reagenzien. Die Kammern werden mit variablen Mengen von den Neukleotiden A, C, G und T sowie einer Substrat- und Enzymlösung bestückt.
4.3.10, Oligonukleotid Micro-Array Analyse:

Prinzip:

In dem Ende der 80er Jahre entwickelten Verfahren können über 50.000 bekannte Gene in Patientenproben aus verschiedenen Geweben identifiziert werden. Die einzelnen Felder des Oligonukleotid Micro-Arrays (CHIP) sind mit einzelsträngigen DNA-Stücken beschichtet und dienen der Bestimmung relativer Änderungen der Genexpression. Durch Zugabe der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Untersuchungsproben binden diese bei komplementärer Basenabfolge an die DNA im CHIP. Die Position, Intensität und Wellenlänge der entstehenden Mischfarbe werden mit einer hochauflösenden Laserkamera detektiert und liefern Informationen über Unterschiede in der Expression der Gene zwischen den beiden Proben. Oligonucleotid Micro-Arrays (HG-U133A, Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) wurden wie vorbeschrieben hybridisiert (Hofmann, de Vos et al. 2002). Die Datenanalyse erfolgte mit der Microarray Suite 5.0 (Affymetrix), DChip und der Genespring Software 4.3 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) (Li and Wong 2001).
4.3.11, Oligonukleotid Micro Array Daten-Analyse mittels Genespring:

Die bioinformatische Auswertung der Geneexpressionsanalysen erfolgt durch den derzeitigen Goldstandard für Expressionsanalysen, mit dem Programm GeneSpring 4.3 (Agilent Technologie). GeneSpring ist speziell für die biologische Auswertung entwickelt worden. Mit dem Programm erfolgt eine schnelle und zuverlässige Auswertung, die sowohl statistisch als auch biologisch aussagekräftig ist. GeneSpring GX beinhaltet außerdem eine Vielzahl von integrierten Statistikprogrammen.
4.4. Statistische Tests:

4.4.1, Korrelationskoeffizient:

Für die Analyse der Genmethylierung in Hinblick auf Genexpression, Alter der Patienten, und Gesamtzahl an weißen Blutzellen wurde der Korrelationskoeffizient nach Pearson bestimmt. Der Korrelationskoeffizient nach Pearson ist ein dimensionsloses Maß für den Grad des linearen Zusammenhangs zwischen zwei mindestens intervall-skalierten Merkmalen. Er kann Werte zwischen -1 und 1 annehmen. Bei einem Wert von +1 (bzw. -1) besteht ein vollständig positiver (bzw. negativer) linearer Zusammenhang zwischen den betrachteten Merkmalen. Wenn der Korrelationskoeffizient den Wert 0 aufweist, hängen die beiden Merkmale überhaupt nicht linear voneinander ab. Allerdings können diese dennoch in nicht-linearer Weise voneinander abhängen.
4.4.2, t-Test:

Die Abhängigkeit von Geschlecht der Probanden zu den Ergebnissen der Metyhlierung- und Genexpressionsanalysen werden mit Hilfe des t-Tests ermittelt. Der t-Test bezeichnet einen Hypothesentest von einer t-verteilten Testprüfgröße. Mit dem hier benutzten Zweistichproben-t-Test prüft man anhand der Mittelwerte zweier Proben, ob die Erwartungswerte zweier Grundgesamtheiten ungleich, kleiner oder größer sind.
4.4.3, Kruskal-Wallis Test und chi-Quadrat-Test:

Werden drei oder mehr Gruppen untersucht, kommt der Kruskal-Wallis und chi-Quadrat Test zur Anwendung. Der Kruskal-Wallis-Test ist ein parameterfreier statistischer Test, mit dem im Rahmen einer Varianzanalyse verglichen wird, ob sich verschiedene unabhängige Gruppen hinsichtlich einer ordinalskalierten Variablen unterscheiden. Die berechnete Prüfgröße wird mit einer theoretischen Größe aus der Chi-Quadrat-Verteilung für eine gewählte Irrtumswahrscheinlichkeit verglichen. Ist der errechnete Wert größer als der Wert aus der Chi-Quadrat-Tabelle, wird die Nullhypothese verworfen; es besteht also ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen.
4.4.4, Kaplan-Meier Überlebenskurve:

Der Überlebenskurven wurden nach dem Kaplan-Meier Schätzer erstellt. Dieser dient zum Schätzen der Wahrscheinlichkeit, ob bei einem Patienten ein bestimmtes Ereignis innerhalb eines Zeitintervalls nicht eintritt. Bei der Kaplan-Meier Methode wird für jeden Zeitpunkt, zu dem ein Ereignis vorliegt, ein Wert für die Survivalfunktion geschätzt. Die zensierten Fälle, die zwischen zwei Ereignissen stattfinden, gehen komplett in die Berechnung der Risikopopulation ein. Implizit verbirgt sich dahinter die Annahme, dass die Zensierungen am Ende des 'Intervalls' stattfinden. Die Anzahl der zensierten Fälle haben keinen Einfluss auf die Schätzwerte der Survivalfunktion für das jeweilige 'Intervall', jedoch reduzieren sie die Risikopopulation des darauf folgenden Intervalls.