Tuberculosis in animals and humans in Eastern Sudan and the genetic diversity among clinical strains of Mycobacterium tuberculosis complex lineage 3

"Tuberkulose in Tieren und Menschen des Ostsudans und genetische Diversität von klinischen Mycobacterium tuberculosis Komplex Isolaten der Linie 3"

Der Sudan gehört zu den Tuberkulose (TB) Hochinzidenzregionen weltweit (77 TB-Fälle pro 100.000 Einwohnern). Besonders der östliche Teil des Landes erreichte in den letzten Jahren TB-Inzidenzraten von bis zu 275 TB-Fälle pro 100.000 Einwohner. Die Prävalenz von Mycobacterium tuberculosis Komplex (MTBK) Stämmen in Wiederkäuern, in der Bevölkerung sowie mögliche Zoonosen sind bisher nur unzureichend untersucht. Weiterhin kann der Ost-Sudan als "Blinder Fleck" bezeichnet werden in Bezug auf verfügbare Daten über Antibiotika Resistenzprofile oder molekulare Resistenzmarker der multiresistenten (MDR) MTBK Stämme, welche resistent gegen die beiden Antibiotika Isoniazid und Rifampicin sind. Die MTBK Linie 3, Delhi/CAS Genotyp, kommt besonders häufig im Sudan und angrenzenden Ländern vor und gilt als Hauptverursacher der TB in diesen Regionen. Trotzdem ist die regionale als auch die globale genetische Diversität und die Übertragungswahrscheinlichkeit der MTBK L3 Stämme nicht umfassend untersucht. Um diese Frage genauer zu analysieren werden in dieser Arbeit die historische Ausbreitung aber auch rezente Übertragungsketten an Hand der genetischen Diversität der Stämme analysiert. Die gewonnen Daten sollen eine detailliertere phylogenetische Struktur aufzeigen und neue Daten für zukünftige molekulare Resistenztests und Mutationsdatenbanken für Resistenzvorhersagen auf Basis einer Gesamtgenomsequenzierungen (WGS) liefern.

Zunächst wurden 2304 Schlachtkadaver von Wiederkäuern aus zwei Schlachtbetrieben in Kassala auf mögliche TB-Granulome untersucht. Darüber hinaus wurden 383 Sputum-Proben von TB-Patienten in Kassala, Port Sudan und El-Gadarif analysiert (Juni-November 2014 und Januar-Juli 2016). Alle Proben wurden im Nationalen TB-Referenzzentrum in Borstel dekontaminiert und MTBK Stämme in Flüssigmedium (BACTEC MGIT 960) und auf Festmedium (Löwenstein-Jensen (LJ) und Stonebrink) kultiviert. Eine Speziesidentifikation bei positive Kulturen erfolgte mit Line Probe Assays und ITS Gensequenzierung. Kulturen wurden weiterhin für die phänotypische Resistenztestung verwendet, MTBK-DNA diente zur molekularen Klassifizierung (Genotypisierung) der Patientenisolate. Die Genotypisierung erfolgte mittels Spoligotypisierung, 24-loci MIRU-VNTR Typisierung und WGS. Kultur negative und kontaminierte Proben wurden mit einer hauseigenen qPCR für die Detektion von mykobakterieller DNA untersucht. Um die globale Populationsstruktur von MTBK L3 Stämmen zu analysieren wurden 1,685 MTBK Isolate aus 22 Ländern aus Afrika, Asien und Europa mittels 24-loci MIRU-VNTR Typisierung analysiert. Phänotypische Resistenztests von 1,070 Stämmen wurden ausgewertet und 159 repräsentative MTBK L3 Isolate für eine WGS Analyse ausgewählt.

Es konnte gezeigt werden, dass lediglich 0.1% (2/2304) der Schlachkadaver von Wiederkäuern mögliche TB-Granulome auswiesen. Keine der beiden Proben enthielt MTBK-Stämme, in einer der Proben konnte ein Stamm mit Ähnlichkeiten zu Mycobacterium terrae nachgewiesen werden. Weiterhin wurden 383 Patientenisolate aus dem Ost-Sudan genotypisiert und in Bezug auf ihr Resistenzprofil untersucht. Molekulare Cluster wurden als Marker für mögliche Übertragungskosten bestimmt. Bakterielles Wachstum konnte in 51.2% (196/383) der Sputum-Proben nachgewiesen werden; 87.2% (171/196) der positiven Proben enthielten M. tuberculosis, 7.2% (14/196) wurden als M. intracellulare klassifiziert, 5.6% (11/196) waren kontaminiert und erlaubten keine eindeutige Speziesbestimmung. Mittels qPCR wurden weiterhin 75.1% (127/169) als MTBK und 4.7% (8/169) als nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTMs) bestimmt. Die Ergebnisse des Kulturnachweises und der qPCR kombiniert resultierten in einem positiven Vorhersagewert von 90.7% (331/365) für den mikroskopischen Nachweis von Mykobakterien in Sputum-Proben aus dem Ost-Sudan. Die Genotypisierung der verfügbaren MTBK-Isolate zeigte folgende Verteilung der unterschiedlichen Linien: 73.4% (130/177) L3, 22.5% (40/177) L4, 2.8% (5/177) L1, und 1.1% (2/177) L2. Phänotypische DST Daten waren für 96.7% (175/181) der MTBK-Stämme verfügbar, 22.3% (39/175) zeigten mindestens eine Resistenz gegen eines der Erstrangmedikamente, 10.3% (18/175) wurden als MDR eingestuft. Weiterhin waren 77.8% (n=14) der MDR-MTBK Isolate einem molekularen Cluster zugeordnet.

Die Analyse der globalen MTBK L3 Kollektion konnte sechs klonale Komplexe basierend auf der 24-loci MIRU-VNTR Typisierung definieren, Delhi/CAS Miru Gruppen (DCMGs) und acht Subgruppen basierend auf der WGS Analyse. Jeder der acht Genombasierten Subgruppen ist durch spezifische Mutationen charakterisiert. Von den MTBK L3 Stämmen mit verfügbaren phänotypischen Resistenzergebnissen wurden 21.5% als MDR klassifiziert wobei nicht alle DCMGs gleichmäßige MDR-TB Proportionen zeigten.

Die Arbeit lässt vermuten, dass MTBK-Stämme in vermeintlichen TB-Granulomen in Schlachtkadavern von Wiederkäuern in Kassala sehr selten sind und eine Übertragung von Tier auf Mensch sehr unwahrscheinlich ist. Weiterhin zeigt die Arbeit, dass spezifischere Labortests, z.B. Xpert MTB/RIF eingesetzt werden sollten, um TB-Patienten eindeutiger zu bestimmen. Einige Sputum-Proben enthielten beispielsweise keine MTBK Stämme oder NTMs. Weiterhin zeigten die Ergebnisse die Übertragung von MDR-MTBK Stämmen und dass MTBK L3 Stämme die Hauptursache einer Lungentuberkulose im Ost-Sudan sind. Armut und Schwächen im TB-Kontrollsystem sowie der der Diagnostik können als potentielle Faktoren angesehen werden, die zum Auftreten von MDR-MTBK Übertragungen im Sudan führen. Diese Fälle müssen in den folgenden Jahren weiterhin sorgfältig überwacht werden und die Einführung von schnellen molekularen DSTs wäre wünschenswert.

In dieser Arbeit wurde eine robuste phylogenetische Klassifizierung von MTBK L3 Stämmen erstellt, welche diese Linie in sechs DCMGs und acht genombasierte Subgruppen unterteilt. Stämme der einzelnen DCMGs zeigen weiterhin unterschiedliche geografische Verteilungen. Es konnte der vermeintliche Ursprung dieser Linie in Süd-Asien bestätigt werden (repräsentiert durch die anzestrale Subgruppe L3.2) und weiterhin die Ausbreitung in andere Teile der Welt nachvollzogen werden. Historische Migrationsbewegungen aber auch rezente Übertragung haben die derzeitige Phylogenie der MTBK L3 Stämme maßgeblich beeinflusst; der Effekt der Antibiotikabehandlung ist eher moderat anzusehen, im Vergleich zu MTBK L2 Stämmen zum Beispiel, und betrifft alle DCMGs gleichermaßen mit Ausnahme von DCMG5, welcher niedrigere MDR-TB Proportionen aufweist. Trotzdem sind über die Hälfte der MDR-MTBK L3 Stämme mit einer rezenten Übertragung assoziiert, so dass dieser Mechanismus auch in Ost-Afrika eine große Bedeutung bei steigenden MDR-TB Raten spielt.

Zusammengefasst zeigt die Arbeit, dass Zoonosen keine große Rolle bei der TB-Epidemiologie spielen, MTBK L3 Stämme die Hauptverursacher der Lungentuberkulose im Ost-Sudan sind und 10% der Patienten als MDR-TB Fall eingestuft werden. Die globale Analyse der MTBK L3 Stämme aus 22 Ländern offenbarte zudem eine größere genetischen Diversität als bisher vermutet wurde und führte zu einem signifikant verbesserten Klassifizierungssystem. Dies wird in Zukunft Studien zur molekularen Analyse von Resistenzdeterminanten dienlich sein und erlaubte neue Einsichten in die Evolutionsgeschichte dieser regional dominierenden MTBK Linie.
 
The Sudan is a high tuberculosis (TB) burden country (i.e. 77 per 100,000 population). Specifically, the eastern part of the country is endemic with high incidence rates of TB reaching up to 275 per 100,000 population during the past decade. Prevalence of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) strains in ruminants and in humans, as well as potential zoonotic spillovers, are only sparsely investigated. Furthermore, Eastern Sudan is a blind spot with regard to drug resistance rates and virtually no data is available on molecular drug resistance markers of circulating multidrug resistant (MDR) MTBC strains that are resistant to at least isoniazid and rifampicin. Particularly, strains of MTBC lineage 3 (L3), i.e. Delhi/CAS genotype, are highly prevalent in the Sudan and adjacent countries and are the main causative agent of TB in those regions, however, their regional and global genetic diversity and transmission capacity are likely not fully captured yet. Thus, this thesis aims to provide a better understanding of historic and recent transmission dynamics, the genetic background of MTBC L3 strains and to draw a robust phylogenetic framework which will serve future molecular drug resistance assays and whole genome sequencing (WGS) mutation catalogues.

First, a total of 2,304 carcasses of ruminants slaughtered at the two slaughterhouses of Kassala were inspected for presence of TB-suggestive lesions (June to November 2014). Second, 383 sputum samples were collected from TB patients at Kassala, Port Sudan, and El-Gadarif teaching hospitals (June to November 2014 and January to July 2016). All collected samples were sent to the National Reference Laboratory (NRL) for Mycobacteria, Borstel in Germany, where all samples were decontaminated and cultured into MGIT liquid medium (BACTEC MGIT 960 system) and onto Löwenstein-Jensen (LJ) and Stonebrink slants. Culture positive samples were subjected to line probe assays and ITS gene sequencing for species identification. Cultures of MTBC strains were subjected to phenotypic drug susceptibility testing (pDST), and MTBC DNA was used for genotypic characterisation (genotyping) using spoligotyping, 24-loci MIRU-VNTR typing, and WGS. Culture-negative and contaminated samples were subjected to an in-house real-time PCR (qPCR) for detection of mycobacterial DNA. Finally, to get insights into MTBC L3 global population structure, a data set containing the results of 24-loci MIRU-VNTR genotyping of 1,685 strains from 22 countries across Asia, Africa, and Europe was analyzed. The pDST of 1,070 of the strains was also analyzed. A total of 159 out of the 1,685 L3 strains representing a wide global diversity were selected for a WGS analysis.

This work showed that only 0.1% (2/2304) of the carcasses of ruminants were found with TB-suggestive lesions. None of the MTBC members was isolated from the collected TB-suggestive lesions but a slow growing Mycobacterium species with the closest similarity to M. terrae group. Furthermore, growth of organisms was obtained from 51.2% (196/383) of TB patients derived sputum samples from Eastern Sudan to identify the MTBC lineage of the infecting strains, molecular clusters as surrogate marker for recent transmission in the region, and drug resistance profiles. Of the isolated bacteria, 87.2% (171/196) were identified as M. tuberculosis and 7.2% (14/196) as M. intracellulare. The remaining 5.6% (11/196) positive cultures had more than one species of bacteria. The qPCR showed that 75.1% (127/169) of the culture-negative and contaminated samples were positive for MTBC DNA and 4.7% (8/169) for nontuberculous mycobacteria (NTM) DNA. Results of culture and qPCR together showed a positive predictive value of 90.7% (331/365) for smear microscopy for detection of mycobacteria in Eastern Sudan. Moreover, MTBC molecular analysis revealed that 73.4% (130/177) belong to L3, 22.5% (40/177) to L4, 2.8% (5/177) to L1, and 1.1% (2/177) to L2. pDST data were available for 96.7% (175/181) of the MTBC strains. A percentage of 22.3% (39/175) of the strains with pDST results available showed resistance to at least one of the tested first line antibiotics, of which 10.3% (18/175) were MDR strains. Furthermore, 77.8% (n=14) of the MDR strains were clustered. Overall MTBC L3 strains are divided into six Delhi/CAS Miru Groups (DCMGs) and into eight WGS-based groups. Each of the eight groups has specific mutations. Of the L3 strains with available pDST data, 21.5% were MDR.

This thesis suggests that the overall prevalence of MTBC strains in TB-suggestive lesions is very low in carcasses of ruminants in Kassala and zoonotic transmission of MTBC bacteria is unlikely. It further suggests the need for more specific laboratory tests such as the Xpert MTB/RIF to avoid possible overtreatment as some sputum samples did not contain MTBC bacteria and few others had only NTMs. Moreover, this work confirmed that L3 strains are responsible for causing the majority of TB cases in Eastern Sudan as well as revealed transmission of MDR MTBC strains. Poverty and weaknesses in TB control and diagnostics are potential factors that lead to the emergence of MDR MTBC transmission in the country. This needs to be carefully traced in the following years and implementation of rapid molecular DSTs should be considered. Indeed, the findings of this work provided a robust phylogenetic classification scheme for L3 strains for future studies by defining six distinct DCMGs and eight WGS-based groups. The defined DCMGs have also distinct spatial distribution. It is most likely that L3 strains emerged in South Asia (with L3.2 as the most ancestral strains) and subsequently spread successfully into other parts of the world. Historic migration waves but also recent transmission likely shaped the MTBC L3 phylogeny. However, the effect of antibiotic treatment is moderate, compared to MTBC L2 strains for instance, and it affects all defined DCMGs equally, except DCMG5 which showed a lower MDR MTBC proportion. Nevertheless, more than half of the MDR MTBC L3 strains were related to recent transmission rendering MTBC L3 strains the possible driver of MDR TB in East Africa.

Jointly, this work showed that zoonotic spillovers of MTBC strains virtually don't occur, and MTBC L3 strains are the main causative agent of TB and are responsible of all MDR TB cases in Eastern Sudan. Moreover, the global genetic analysis of MTBC L3 strains from 22 different countries revealed that the MTBC L3's genetic diversity is higher than currently expected. This finding has significantly improved the classification system and will serve future studies on molecular drug resistance determinants. The finding further provided insights in the evolutionary history of this regionally dominating MTBC lineage.