New insights into the role of cholesterol-related pathways in apicomplexan parasite infections

Kokzidien sind Krankheitserreger von Mensch und Tier und gehören zu obligat intrazellulären Parasiten, die im Stamm der Apikomplexa eingeordnet werden. Veterinärmedizinisch relevante Kokzidien befinden sich in verschiedene Familien, wie den Sarcocystidae (z. B. Toxoplasma gondii, Neospora caninum und Besnoitita besnoiti) und Eimeriidae (z. B. Eimeria bovis und Eimeria arloingi), die sich hinsichtlich Lebenszyklus und Wirtsspezifität unterscheiden. Diese intrazellulär lebenden Parasiten sind für ihre Entwicklung vom Metabolismus ihrer Wirtszelle abhängig. So werden komplexe Moleküle - wie etwa Cholesterol - aus den Wirtszellen entnommen, um die proliferativen Anforderungen des Parasiten zu erfüllen. Grundsätzlich können Zellen Cholesterol durch de-novo-Biosynthese oder extrazelluläre Aufnahme bereitstellen. Letztere wird vornehmlich über die Aufnahme von LDL vermittelt. Vor allem diesen Weg scheinen Kokzidien für sich zu nutzen. Insgesamt sind jedoch sind die Kenntnisse zur Cholesterolaufnahme durch Kokzidien noch lückenhaft und nicht für alle Arten repräsentativ. So wurden alternative Aufnahmewege zum Cholesterol, die von bestimmten Rezeptoren und Transportern wie NPC1L1, P-pg oder SR-BI abhängig sind, bisher kaum in Betracht gezogen. Die vorliegende Arbeit befasst sich deshalb mit dieser Thematik und führte zu folgenden Ergebnissen:
Eine GC-MS-basierte Analyse von Cholesterol-assoziierten Sterolen in B. besnoiti-infizierten primären Endothelzellen zeigte eine Zunahme von Cholesterol-Vorstufen. Zusammen mit einer Statin-vermittelten Hemmung der B. besnoiti-Replikation deuten diese Daten auf eine wichtige Rolle der de-novo Biosynthese in infizierten Wirtszellen hin. Dass die acLDL-Supplementierung die B. besnoiti-Vermehrung verstärkte, weist zudem auf acLDL als zusätzliche, extrazelluläre Cholesterolquelle hin und zeigte auf, dass dieser Parasit alternative Wege zur Deckung des Cholesterolbedarfs nutzt. Im Falle von E. bovis-Infektionen belegten Sterolanalysen eine signifikante Zunahme von Phytosterolen während der ersten Merogonie, was auf eine Abhängigkeit der intrazellulären Parasitenentwicklung von extrazellulären Cholesterolquellen hinweist. Zudem ergab die Analyse von Cholesterinmetaboliten eine gesteigerte Bildung von Cholesterylestern und Oxysterolen (insbesondere 25-Hydroxycholesterin). Da der exogene Zusatz von Oxysterolen die Entwicklung von E. bovis Makromeronten behinderte, könnte die gesteigerte Synthese dieser Moleküle auch Ausdruck einer Abwehrreaktionen infizierter Wirtszellen sein.
Eine Beteiligung weiterer cholesterolassoziierter Wege zeigte die Anwendung von Ezetimib als NPC1L1-Blocker, die signifikante parasitostatische Effekte auf die Proliferation von T. gondii-, N. caninum- und B. besnoiti-Tachyzoiten ergab. Behandlungen mit dem in vivo aktiven Metaboliten (glucuroniertes Ezetimib) bewirkten jedoch keine parasitostatische Wirkungen. Zusammen mit der inkonsistente Genexpression von NPC1L1 in infizierten Zellen legte dies nahe, dass Ezetimib die Parasitenreplikation durch einen NPC1L1-unabhängigen Mechanismus beeinflusst. Außerdem zeigte die chemische Blockade des im Cholesterolstoffwechsel eingebundenen ABC-Transporters P-gp durch verschiedene Inhibitorgenerationen (Verapamil, Valspodar, Tariquidar) deutliche Unterschiede in ihrer antiparasitären Wirksamkeit. Während Behandlungen mit Verapamil signifikant die Replikation von T. gondii, N. caninum und B. besnoiti hemmten und eine Anreicherung neutraler Lipide in Wirtszellen erzeugten, zeigten Valspodar-Behandlungen zwar ebenfalls anti-invasive und anti-proliferative Wirkungen, ohne jedoch die Abundanz neutraler Lipide zu beeinflussen. Im Gegensatz dazu verringerte der spezifischste P-gp-Inhibitor Tariquidar ausschließlich die Invasion und Replikation von B. besnoiti, wirkte sich jedoch nicht auf T. gondii oder N. caninum aus, was parasitenspezifische Reaktionen nahelegt. Interessanterweise induzierte die Blockade des Scavenger-Rezeptors SR-BI durch BLT-1-Behandlungen signifikante hemmende Effekte sowohl auf die schnell replizierenden Kokzidien T. gondii, N. caninum und B. besnoiti als auch auf die pathogenen Eimeria-Spezies E. bovis und E. arloingi, was konservierte, SR-BI-assoziierte Mechanismen bei der intrazellulären Kokzidien-Replikation nahelegt. BLT-1-Behandlungen freier Sporozoiten und Tachyzoiten beinflussten jedoch ausschließlich die invasive Kapazität der letzteren Gruppe, begleitet von einem anhaltenden Ca++-Flux in diesen Parasitenstadien.
Schließlich belegten Studien zum Zellaustritt von N. caninum über Live-Cell-Imaging, dass dieser mit einer infektionsbedingten Ca++-Umverteilung mit erhöhten Ca++-Signalen innerhalb der Meronten verbunden war. Analysen zum ionophorinduzierten Austritt von N. caninum zeigten zudem, dass die Austrittsleistung des Parasiten hauptsächlich von der Merontenreife beeinflusst wurde und dass Ionophorbehandlungen keine Ca++-Umverteilung zwischen unterschiedlichen Infektionszeitpunkten (24 oder 42 h p. i.) verursachte.
 
Coccidia are a large family of obligate intracellular parasites that belong to the apicomplexan phylum and are responsible for diseases in human and animal populations. In this context, veterinary-relevant coccidian species are grouped into certain families, such as Sarcocistidae (i. e. Toxoplasma gondii, Neospora caninum and Besnoitia besnoiti) and Eimeriidae (i. e. Eimeria bovis and Eimeria arloingi) which largely differ in terms of life cycle and host specificity. It is well-known that coccidian parasites highly rely on host cell metabolism and their capacity to hijack their host cell to fulfill their metabolic requirements during intracellular development. In that context, complex molecules like cholesterol are scavenged from host cells to sustain proliferative requirements. Physiologically, cells obtain cholesterol either by de novo biosynthesis or by extracellular uptake. The latter is largely driven by LDL internalization in mammalian cells, which is accepted as pivotal route to be exploited by apicomplexan parasites. Nevertheless, since coccidian biology largely differs between species, the overall knowledge on cholesterol acquisition by coccidia has been oversimplified. As such, alternative cholesterol-related acquisition routes driven by NPC1L1, P-pg and SR-BI have scarcely been considered, so far. Related to these topics, the following results were achieved in the current work:
GC-MS-based profiling of cholesterol-related sterols in B. besnoiti-infected primary endothelial cells showed an enhancement of several cholesterol precursors. Together with the finding of statin-mediated inhibition of B. besnoiti replication, these data strongly suggest a key role of cholesterol de novo biosynthesis in infected host cells. Furthermore, beneficial effects of LDL-supplementation on parasite proliferation proved acLDL as pivotal extracellular cholesterol source for B. besnoiti replication, thereby indicating that this coccidian parasite exploits alternative routes to sustain its cholesterol requirements. Moreover, in the case of E. bovis first merogony, lipidomic profiling revealed an enhancement of phytosterols over time indicating that this coccidian parasite significantly relies on extracellular sources for cholesterol acquisition. Interestingly, analysis of downstream cholesterol metabolites additionally documented an accumulation of cholesteryl esters and oxysterols (especially 25 hydroxycholesterol) throughout first merogony. Considering that exogenous oxysterols treatments impeded E. bovis macromeront
development, these molecules may also result from anti-parasitic responses of infected-host cells.
Regarding the participation of alternative cholesterol-related routes, the use of ezetimibe as NPC1L1 blocker revealed strong parasitostatic effects on T. gondii, N. caninum and B. besnoiti tachzoite proliferation. However, the absence of anti-coccidian effects driven by the in vivo active metabolite (glucoronated ezetimibe), in addition to the inconsistent gene expression of NPC1L1 in infected cells suggest that ezetimibe might affect parasite replication by an NPC1L1-independent mechanism. Additionally, chemical blockage of the ABC transporter P-gp by different generations of inhibitors (verapamil, valspodar, tariquidar) revealed differences in terms of anti-coccidian efficacies. Specifically, treatments with verapamil consistently reduced T. gondii, N. caninum and B. besnoiti replication and generated neutral lipid accumulation in host cells. Likewise, valspodar treatments induced singnificant anti-invasive and anti-proliferative effects in these three parasite species but failed to influence cellular neutral lipid abundance. In contrast, the most specific P-gp inhibitor tariquidar exclusively diminished B. besnoiti invasion and replication but failed to affect T. gondii or N. caninum, thereby suggesting parasite-specific reactions. Interestingly, blockage of the scavenger receptor SR-BI by BLT-1 treatments induced significant anti-replicative effects not only in the fast-replicating coccidia T. gondii, N. caninum and B. besnoiti, but also in the pathogenic Eimeria species E. bovis and E. arloingi, thereby evidencing potentially conserved SR-BI-related mechanisms as key events for coccidian replication. However, BLT-1 treatments of free sporozoites and tachyzoites exclusively affected host cell invasion capacity in the latter group, being paralleled with a sustained Ca++ flux over time.
Finally, studies on N. caninum host cell egress by live cell imaging revealed an infection-driven Ca++ redistribution leading to increased Ca++ signals within intracellular N. caninum meronts. Furthermore, analyses on ionophore-induced N. caninum egress proved egress performance to be mainly influenced by meront maturity and showed no differences in Ca++ redistribution between time points of infection (24 or 42 h p. i.).