Extraktion und chromatographische Analytik von freien Fettsäuren aus Stuhlproben

Die Zusammensetzung von Säuglings-Formulanahrung sowie die Positionierung der Palmitinsäure innerhalb des Triacylglycerolmoleküls können einen Einfluss auf die Stuhlkonsistenz der Säuglinge haben (Innis et al., 1994). Ein erhöhter sn-2-Palmitinsäure-Gehalt (Palmitinsäure an mittelständiger sn-2-Position des Glycerolmoleküls verestert) in der Säuglings-Formulanahrung steht im Zusammenhang mit einer Reduktion der Stuhl Fettsäuren-Seifen sowie weicherer Stuhl-Konsistenz bei Säuglingen mit Konstipationsbeschwerden (Bongers et al., 2007). Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zur Extraktion und chromatographischen Analyse von freien Fettsäuren aus Säuglingsstuhlproben zu etablieren und zu validieren.
Da die Gewinnung von Säuglingsstuhlproben in den ersten Lebensmonaten aufgrund von geringen Stuhlmengen eine Herausforderung darstellt, wurde die Analyse mit so geringen Stuhlprobenmengen wie möglich durchgeführt. Es konnte eine Einwaage von 0,1 g Trockenstuhl für die Bestimmung der Gesamt-Fettsäuren sowie eine Einwaage von 0,2 g Trockenstuhl für die Analyse der unverseiften Fettsäuren erreicht werden. Weiterhin sollte die Soxhlet-Analysedauer von 16 Stunden verkürzt werden, um zukünftig mehr Proben in kürzerer Zeit analysieren zu können. Allerdings wurde aufgrund der schlechteren VK-Werte bei einer verkürzten 12-stündigen Soxhlet-Analysezeit für die Methodenetablierung die 16-stündige Soxhlet-Extraktion gewählt.
Weiterführend wurde die etablierte Methode im Rahmen einer klinischen Interventionsstudie eingesetzt. Ziel der Studie war es, die Ausscheidung der Fettsäuren-Seifen, organische Säuren einschließlich kurzkettigen Fettsäuren und das Fettsäurenprofil der Erythrozytenmembran von Säuglingen, die entweder mit einer modifizierten Formulanahrung (Verum) mit einem erhöhten sn-2-Palmitinsäure-Gehalt (25,4 % Palmitinsäure in sn-2-Veresterung), unter Zugabe von 0,5 g/100 ml GOS, oder einer Standard-Formularnahrung (Kontrolle) (< 10 % Palmitinsäure in sn-2-Veresterung innerhalb des Glycerolmoleküls) gefüttert worden sind, zu untersuchen. Parallel hierzu wurde eine nicht-randomisierte Gruppe mit Muttermilch-ernährten Säuglingen untersucht.
Die Stuhlproben wurden im Alter von 37 - 47 Lebenstagen (Studientag 2 = ST2) gesammelt und gefriergetrocknet. Die Lipidextraktion der Gesamt-Fettsäuren erfolgte mit Hilfe einer Petrolether/Salzsäure-Mischung. Nach Trennung der Petrolether/Fettsäuren-Schicht und Trocknung wurde die Probe in Chloroform gelöst und für die Derivatisierung vorbereitet. Die unverseiften Fettsäuren wurden mit Hilfe der Soxhlet-Anlage 16 Stunden mit Petrolether extrahiert. Nach Trocknung der Probe wurde diese in Chloroform gelöst und ebenfalls für die Derivatisierung vorbereitet. Zur Umwandlung der Fettsäuren in Methylester wurden die Proben zuerst mit Chloroform behandelt und mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie separiert. Die Banden der freien Fettsäuren wurden in ein Röhrchen gefüllt und mit dem Methylierungsreagenz (Methanol/Salzsäure) bei 95 °C für vier Stunden inkubiert. Am Ende konnten die Proben in Heptan gelöst und mit Hilfe der Gaschromatographie analysiert werden (Varian medical systems, Palo Alto, USA). Die verseiften Fettsäuren wurden aus der Differenz der Gesamt- und unverseiften Fettsäuren arithmetisch berechnet. Die Fettsäuren-Seifen wurden in µmol pro g Trockenstuhl dargestellt. Für die Analyse der organischen Säuren einschließlich kurzkettigen Fettsäuren wurden die Proben mit Wasser und Acetonitril behandelt und nach anschließender Filtration mit Hilfe der HPLC analysiert. Die venösen Blutproben wurden im Alter von 3 - 10 Lebenstagen (Studientag 1 = ST1) und an ST2 gesammelt, um sicherzustellen, dass die modifizierte Formulanahrung mit hohem sn-2-Palmitinsäure-Gehalt keinen negativen Effekt auf die essenziellen Fettsäuren hatte. Die Fütterungsmengen der Formula-Gruppen wurden zu ST2 und ST3 (Studientag 3 = Alter von 77 - 91 Lebenstagen) und die anthropometrischen Messungen an ST1 und ST3 erhoben.
Die Ergebnisse zeigten, dass es keine Unterschiede hinsichtlich der Fettsäuren-Seifen-, Palmitin-Seifen-, Gesamt-Fettsäuren- und organische Säuren- einschließlich SCFAs-Konzentrationen in den Stuhlproben zwischen der Verum- und Kontroll-Gruppe gab. Allerdings wies die MM-Gruppe signifikant niedrigere Konzentrationen der ausgeschiedenen Fettsäuren-Seifen, Palmitinsäure-Seife, Gesamt-Fettsäuren sowie der SCFAs Essig- und Propionsäure und höhere Konzentrationen der Ameisen- und Brenztraubensäure im Vergleich zur Verum- und Kontroll-Gruppe auf. Der Gehalt der LA (C 18:2n6) und ALA (C 18:3n3) stieg in den Erythrozyten der Säuglinge in allen drei Gruppen von ST1 zu ST2 signifikant an. Die Kontroll-Gruppe wies signifikant niedrigere AA und DHA Konzentrationen im Vergleich zur MM-Gruppe zu ST2 auf. Die Säuglinge, welche eine modifizierte Formula mit erhöhtem sn-2-Palmitinsäure-Gehalt unter Zugabe von 0,5 g/100 ml GOS erhielten, zeigten nicht die erwarteten positiven Effekte bezüglich der Fettsäuren-Zusammensetzung im Stuhl.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der entwickelten Methodik für die durchgeführte klinische Interventionsstudie ausreichend sind. Eine Verbesserung der hier entwickelten Methodik würde zu keiner signifikanten Verbesserung der klinischen Interventionsstudieergebnisse führen.