Vergleichende epidemiologische und molekularbiologische Untersuchung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) aus Nutztierhaltungen und deren Umgebung

Comparative epidemiological and molecular biological analysis of methicillin-resistent Staphylococcus aureus (MRSA) from livestock and its environment

Within the scope of this present study, selected samples which were isolated in the course of a partial project between the Free University Berlin and the Veterinary University Hannover from 2009 to 2011, have been further investigated. The objective of that previous study was to comprehensively determine the occurrence of MRSA in barn air and housing environment in animal husbandries of different animal species in Germany. To estimate an appropriate transfer risk of airborne MRSA from livestock to other animal populations or local residents, field studies have been performed in conventional pig and poultry farms.
Within the following thesis the emission of MRSA from barn air to the vicinity of the farms should be proven by using molecular biological analysis. Furthermore, a differentiated evaluation regarding to the tenacity and pathogenicity of transmitted and sedimented MRSA should be performed. Finally, results of macrorestriction analysis were compared to an approach of using protein spectra obtained by MALDI-TOF-MS for molecular epidemiology.

Overall 238 selected MRSA isolates originating from four fattening pig farms and two breeding pig farms as well as two broiler and four turkey fattening farms were further investigated. The spa- typing demonstrated that in pig barns and its environment the spa-types t011, t108 and t1451 were identified most frequently, whereas t011, t5452 and t034 dominated in the inside and outside of the turkey farms respectively t1430 in the broiler farms. The majority of the selected isolates (87%) were assigned to clonal complex 398. All so-called non-CC398 strains (13%) were assigned to sequence type ST9 or ST5. A simultaneous detection of the same MRSA spa types inside the barns and within the whole farm confirmed the hypothesis of the previous study that an emission via the airborne route has been occured.
The clonal analysis was performed by Cfr9I pulsed-field gel electrophoresis. Therefore 124 MRSA isolates (60 from pig farms, 34 from broiler farms and 30 from turkey farms) were chosen. The results demonstrated the presence of MRSA clones in the barn air and housing environment of investigated animal husbandrys. In addition, MRSA clones could also be detected in air samples from inside as well as from outside on the downwind site up to a distance to 50m and 150m, respectively. Because air sampling was performed simultaneously we can assume a proven airborne transmission of MRSA from livestock.

In order to compare transmitted and sedimented MRSA under changing environmental conditions, pig isolates from summer and winter samplings were investigated. As a result, MRSA clones were detected in samples from winter and the following summer at identical distances. This confirms the hypothesis of the previous study that sedimented MRSA strains show high tenacity in the environment by surviving longer periods on soil surfaces.

Additionally, a series of 38 samples were selected for microarray analysis. Investigated MRSA strains displayed only a low presence of virulence associated genes. Resistance genes for beta-lactam antimicrobials were detected in all isolates. Genes mediating resistance to other antimicrobial classes were also frequently detected. Furthermore, the Panton-Valentine Leukozidin gene and the Toxic Shock Syndrome Toxin gene could not be identified in any of the positive MRSA strains. While all investigated MRSA strains might be able to form bacterial biofilms, genes for staphylococcal entertoxins were found in only 31,6 % of the investigated isolates. However, the detection of antibiotic resistance genes or genes encoding for SE does not mean that appropriate genes will be expresses and own a pathogenic potential for humans and animals

Finally protein mass spectra obtained by MALDI-TOF-MS and macrorestriction analysis were compared with each other in regard of their usability for molecular epidemiology. Phylogenetics on the basis of PFGE analysis is widely accepted. Cluster analysis of protein spectra differed substantially from the widly PFGE ones. For this reason using MALDI-TOF-MS for typing MRSA for epidemiology purpose is not recommended yet. However, further investigations on this topic seem to be necessary and useful.
 
Die vorliegende Arbeit beinhaltet die weiterführende Untersuchung von ausgewählten Proben, die im Zuge eines Teilprojektes zwischen der Freien Universität Berlin und der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Erfüllung eines Entscheidungshilfebedarfs des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz von 2009 - 2011 isoliert wurden. Ziel des Teilprojektes war es, das Vorkommen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) in der Stallluft und Abluft von Tierhaltungen verschiedener Tierarten zu untersuchen. Um ein entsprechendes Übertragungsrisiko luftgetragener MRSA aus Nutztierställen auf andere Tierbestände oder Anwohner in der Umgebung einschätzen zu können, wurden Feldstudien in konventionellen Schweine- und Geflügelbetrieben durchgeführt.
Mittels molekularbiologischer Analyseverfahren sollte im Rahmen dieser Dissertation dann der aerogene Austrag von MRSA aus dem Tierstall in die direkte Stallumgebung eindeutig belegt sowie eine differenzierte Beurteilung bezüglich der Tenazität und Pathogenität emittierter und deponierter MRSA getroffen werden. Zusätzlich hierzu erfolgte eine vergleichende Evaluierung generierter Daten aus MALDI-TOF-MS und Makrorestriktionsanalysen, um diese beiden Typisierungsmethoden hinsichtlich ihrer diagnostischen Diversität bzw. Gleichwertigkeit beurteilen zu können.

Die wesentlichen Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Insgesamt wurden 238 ausgewählte MRSA-Isolate, die aus vier Schweinemast- und zwei Schweinezuchtbeständen sowie aus zwei Masthähnchen- und vier Putenmastbeständen stammten, weiterführend charakterisiert. Die spa-Typisierung zeigte, dass im Innen- sowie Außenbereich der jeweiligen Schweinebestände die spa-Typen t011, t108 und t1451 dominierten, wohingegen in den Putenmastbeständen t011, t5452 und t034 bzw. in den Masthähnchenbeständen t1430 am häufigsten innen und außen nachgewiesen wurden. Während die Mehrzahl der Isolate (87%) dem klonalen Komplex CC398 zugeordnet wurde, gehörten alle übrigen sogenannten Non-CC398 MRSA-Stämme (13%) den Sequenztypen ST9 bzw. ST5 an.
Das Vorkommen von identischen spa-Typen im Innen- und Außenbereich der Nutztierhaltungen untermauert die bereits früher in diesem Projekt getroffene Annahme, dass eine luftgetragene Verbreitung von MRSA in die Umwelt stattgefunden haben könnte.
Für die klonale Verwandtschaftsanalyse mittels Cfr9I-Makrorestriktionsanalyse und anschließender Pulsfeldgelelektrophorese wurden insgesamt 124 MRSA-Isolate, davon 60 aus Schweine-, 34 aus Masthähnchen- sowie 30 aus Putenmastbeständen ausgewählt.
Die Analyse zeigte, dass in allen untersuchten Beständen identische MRSA-Klone sowohl im Innen- als auch im Außenbereich vorkamen und sogar in Luftproben aus dem Tierstall bzw. der Stallumgebung bis zu einer Entfernung von 50 m bzw.150 m auf der windabgewandten Seite nachgewiesen wurden. Da die Luftprobenahmen stets zeitsimultan erfolgten, kann hier von einer nachgewiesenen aerogenen Emission von MRSA aus dem Tierstall in die direkte Stallumgebung ausgegangen werden.
Für die Gegenüberstellung von emittierten und deponierter MRSA unter wechselnden Umweltbedingungen, wurden in den Schweinebeständen zusätzlich Isolate aus der Winter und Sommerprobenahme miteinander verglichen. So gelang beispielsweise der Nachweis von identischen MRSA-Klonen in identischen Entfernung im Winter sowie im darauffolgenden Sommer. Die Erkenntnis, dass der Erreger über mehrere Monate in der Umwelt überdauert haben muss, bekräftigt die Annahme aus der Vorgängerstudie bezüglich einer erheblichen Umwelttenazität.
Die Genexpressionsanalyse von ausgewählten Isolaten (n=38) mittels eines S. aureus spezifischen DNA-Microarrays wies letztlich auf eine nur schwache Ausstattung der MRSA-Stämme mit virulenzassoziierten Genen hin. Im Detail wurde bei allen untersuchten MRSA-Stämmen das Methicillin-Resistenzgen mecA sowie das Penicillin-Resistenz vermittelnde ß-Lactamse-Gen blaZ nachgewiesen. Darüberhinaus traten auch weitere Antibiotikaresistenzgene regelmäßig auf. Das Panton-Valentine Leukozidin-Gen sowie das Toxic-Shock-Syndrom-Toxin-Gen konnte bei keinem der untersuchten MRSA-positiven Stämme detektiert werden. Darüber hinaus ließen sich bei allen Isolaten, Biofilm-assoziierte Gene nachweisen. 31,6 % zeigten sogar eine mögliche Fähigkeit zur Bildung von sogenannten Staphylokokken-Enterotoxinen (SE). Jedoch bedeutet die Detektion entsprechender Gene mittels Microarray-Technologie nicht unweigerlich, dass diese auch zur Expression gelangen müssen und folglich ein krankmachendes Potential für Mensch und Tier besitzen.

Abschließend erfolgte die Gegenüberstellung der Daten aus MALDI-TOF-MS und Makrorestriktionsanalyse, wobei der direkte Vergleich der generierten Clusteranalysen zu keinem einheitlichen Ergebnis führte. Während sie zur Spezies- und Subspeziesidentifikation ausgezeichnet geeignet ist, kann die MALDI-TOF-MS-Analyse nach aktuellem Entwicklungsstand nicht zur MRSA-Feintypisierung für epidemiologische Fragestellungen empfohlen werden. Weiterführende Untersuchungen erscheinen diesbezüglich jedoch erforderlich und sinnvoll.