Weitere Aufklärung molekularer Details zur Pathogen-Wirt-Beziehung im Verlauf der Pathogenese einer Infektion von Bienenlarven mit Paenibacillus larvae

One of the most devastating diseases of honey bees worldwide is the epizootic American Foulbrood (AFB) caused by Paenibacillus larvae, which exclusively damages the brood. Honey bee larvae become infected by ingesting spore contaminated food. After germination of the spores in the midgut lumen, P. lavae follows a non-invasive, commensal lifestyle and vegetative bacteria start to massively proliferate. After degradation of the peritrophic membrane P. larvae switches to an invasive, destructive lifestyle and attacks the midgut epithelium of the larva. After breaching the midgut epithelium, P. larvae enters the hemocoel leading to a generalized infection and the death of the host. The aim of this thesis was the further elucidation of molecular details of the host-pathogen interaction during pathogenesis of an infection of bee larvae with P. larvae. For this purpose two confirmed virulence factors were further investigated: PlCBP49 secreted by P. larvae genotypes ERIC I and ERIC II, as well as the ERIC II specific S-layer protein SplA.
At first a further characterization of PlCBP49, a virulence factor with chitin-binding and -degrading activity, was performed. This general virulence factor is used by P. larvae genotypes ERIC I and ERIC II to degrade the peritrophic membrane (PM). Since the degradation of the PM marks the transition from non-invasive to invasive lifestyle and PlCBP49 is secreted from both P. larvae genotypes, this could be a possible intervention point in the control of AFB. In context of this work additional similarities of PlCBP49 and CBP21 of Serratia marcescens, a well described member of the AA10 family of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), could be demonstrated. Therefor cbp49 was successfully expressed in E. coli and assays were performed to further functionally and biochemically characterize PlCBP49. Besides the preference for ß-chitin as substrate, the best substrate turnover was achieved after two hours of incubation at pH 7. These results and the first product profile of PlCBP49 illustrate many similarities with CBP21. The assumption that PlCBP49 degrades chitin substrates like CBP21 over a metal ion-dependent, oxidative mechanism could be sustained and the results of this work describe basic parameters for future in-depth studies.
In this study the ERIC II-specific S-layer Protein SplA was expressed in the naturally SplAdeficient ERIC I strain ATCC9545. The heterologous expression could be verified in vivo by fluorescence-labelled monoclonal antibodies and fluorescence microscopy. In exposure bioassays with the ERIC I+splA mutant no hyper-virulence in comparison with the wild type could be detected. Cloning of only one virulence factor is not sufficient to initiate the complete pathogenetic strategy of P. larvae ERIC II. Additional not yet known factors are presumably necessary to trigger the complex pathogenetic strategy.
The investigation of the immune response of larva during an infection with P. larvae was already subject of several studies with contradicting results. The influence of the infecting P. larvae genotype has been utterly neglected. Through the comparative transcriptome analysis, via RNA-Seq, it could be demonstrated that an infection of larvae with the different P. larvae genotypes ERIC I or ERIC II, results in a change of expression of immune-relevant genes three days after infection. The increased expression of antimicrobial peptides (AMPs) was outstanding. Depending on the infecting P. larvae genotype different combinations of AMPs were expressed. Furthermore a stronger immune response was observed in ERIC IIinfected larvae and the assumed masking of P. larvae ERIC II through the S-layer protein could be rejected. These results point to a genotype-specific immune response of larvae to a P. larvae infection. Although insects are devoid of an adaptive immune system, in the present study it could be demonstrated that not solely the species of the pathogen, but also the infecting genotype is a crucial factor and has profound influence on the host immune response. Further investigations of the host-pathogen interaction of honey bee larvae and P. larvae need to consider the infecting genotype of the pathogen.
In an additional experiment the expression of selected immune-relevant genes was analysed in individual larvae and the results of the comparative transcriptome analysis could be verified. In addition to the expression of different AMPs, depending on the infecting genotype, a stronger immune response in ERIC II-infected larvae could be approved. Since ERIC IIinfected larvae die within a very short time and mount a stronger immune response, it seems likely that the costly immune response contributes to the premature death of the larva.
Taken together in this thesis the general virulence factor PlCBP49 was further biochemically characterized. In addition the investigation of the pathogenetic strategy of P. larvae ERIC II was advanced through the heterologous expression of SplA in P. larvae ERIC I. Furthermore the immune response of the larva was analysed and it could be demonstrated that not only the pathogen species, but also the genotype is crucial for the host immune response. Thesen results broaden our understanding of host-pathogen interaction of honey bee larvae and P. larvae.
 
Eine der verheerendsten weltweit verbreiteten Erkrankungen der Honigbiene ist die durch Paenibacillus larvae verursachte Amerikanische Faulbrut (AFB), welche ausschließlich die Brut schädigt. Honigbienenlarven infizieren sich über sporenhaltiges Futter und nach Auskeimung der Sporen lebt P. larvae zunächst kommensal im Larvendarm, wo er sich massiv vermehrt. P. larvae baut die peritrophe Membran ab und geht ab einem bestimmten Zeitpunkt in die invasive Lebensphase über und greift das Darmepithel der Larve an. Nach dem Durchbruch des Darmepithels kommt es mit dem Übertritt von P. larvae in das Hämocoel zu einer generalisierten Infektion und zum Tod der Larve. Ziel der vorliegenden Arbeit war die weitere Aufklärung molekularer Details der Wirt-Pathogen-Interaktion im Verlauf der Pathogenese einer Infektion von Bienenlarven mit P. larvae. Dazu erfolgte die weitere Untersuchung zweier bereits gezeigter Virulenzfaktoren: das von den P. larvae Genotypen ERIC I und ERIC II produzierte PlCBP49 sowie das ERIC II-spezifische S-layer Protein SplA.
Zunächst erfolgte die weitere Charakterisierung von PlCBP49, einem Virulenzfaktor mit chitinbindender und -abbauender Aktivität. Dieser allgemeine Virulenzfaktor wird sowohl vom P. larvae Genotyp ERIC I als auch dem Genotyp ERIC II genutzt, um die peritrophe Membran (PM) abzubauen. Da der Abbau der PM den Übergang von der nicht-invasiven zur invasiven Lebensphase von P. larvae markiert und PlCBP49 von beiden P. larvae Genotypen sezerniert wird, könnte dies ein möglicher Interventionspunkt in der Bekämpfung der AFB sein. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Gemeinsamkeiten von PlCBP49 und CBP21 von Serratia marcescens, einem bereits beschriebenen Mitglied der AA10 Familie lytischer Polysaccharid-Monooxygenasen (LPMOs), gezeigt werden. Hierfür wurde cbp49 erstmals erfolgreich heterolog in E. coli exprimiert und in funktionellen Assays weiter biochemisch charakterisiert. Neben der Substratpräferenz für ß-Chitin konnten die besten Substratumsätze bei zweistündiger Inkubation bei pH 7 beobachtet werden. Diese Ergebnisse sowie das erstmals gezeigte Produktprofil von PlCBP49 weisen viele Gemeinsamkeiten mit CBP21 auf. Die Vermutung, dass PlCBP49 Chitin wie CBP21 ebenfalls über einen metallionen-abhängigen oxidativen Mechanismus abbaut, konnte weiter bekräftigt werden und die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben die Rahmenbedingungen für vertiefende Studien.
Das ERIC II-spezifische S-layer Protein SplA wurde im Rahmen dieser Arbeit in dem natürlicherweise SplA-defizienten ERIC I Stamm ATCC9545 exprimiert. Die heterologe Expression konnte in vivo mit Fluoreszenzfarbstoff markierten monoklonalen Antikörpern und Fluoreszenzmikroskopie erfolgreich nachgewiesen werden. In Larveninfektionsversuchen mit der ERIC I+splA Mutante konnte keine Hypervirulenz im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden. Die Klonierung eines einzelnen Virulenzfaktors reicht demnach nicht aus, um die Pathogenesestrategie von P. larvae ERIC II auszulösen. Es sind also vermutlich noch weitere unbekannte Faktoren notwendig, um die komplexe Pathogenesestrategie auszulösen.
Die Untersuchung der Immunantwort der Larve bei Infektion mit P. larvae war bereits Gegenstand einiger Studien und führte meist zu widersprüchlichen Ergebnissen. Der Einfluss des infizierenden P. larvae Genotyps wurde dabei nicht weiter beachtet. Durch die in dieser Studie durchgeführte vergleichende Transkriptomanalyse mittels RNA-Seq konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit den P. larvae Genotypen ERIC I bzw. ERIC II drei Tage nach Infektion zu einer veränderten Expression immunrelevanter Gene führt. Die gesteigerte Expression antimikrobieller Peptide (AMPs) trat besonders hervor. Je nach infizierendem P. larvae Genotyp wurde eine unterschiedliche Kombination von AMPs signifikant exprimiert. Außerdem konnte eine stärkere Immunantwort in ERIC II-infizierten Larven festgestellt werden, was die vermutete Maskierung von P. larvae ERIC II durch das S-layer Protein widerlegt. Diese Ergebnisse weisen stark auf eine genotypspezifische Immunantwort der Larve hin. Obwohl Insekten kein adaptives Immunsystem besitzen, konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass nicht nur die Spezies des Pathogens, sondern auch der infizierende Genotyp von entscheidender Bedeutung ist und die Immunantwort des Wirts maßgebliche beeinflusst. Bei der weiteren Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktionen zwischen der Bienenlarve und P. larvae muss der infizierende Genotyp des Pathogens ebenfalls berücksichtigt werden.
In einem weiteren Experiment konnte die Analyse der Expression ausgewählter Immungene in individuellen Larven, die Ergebnisse der bioinformatischen Analyse der RNA-Seq-Daten bestätigten. Neben der Expression unterschiedlicher AMPs, je nach infizierendem Genotyp, konnte eine stärkere Immunreaktion in ERIC II-infizierten Larven bestätigt werden. Da ERIC II-infizierte Larven innerhalb kürzester Zeit versterben und eine stärkere Immunreaktion aufweisen, liegt die Vermutung nahe, dass die aufgebrachte kostspielige Immunantwort am vorzeitigen Tod der Larve beteiligt sein könnte.
Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit der allgemeine Virulenzfaktor PlCBP49 weiter biochemisch charakterisiert sowie die Pathogenesestrategie von P. larvae ERIC II durch die heterologe Expression von SplA in P. larvae ERIC I weiter untersucht. Darüber hinaus wurde die Immunantwort der Larve untersucht und es konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Spezies des Pathogens, sondern auch dessen Genotyp entscheidend für die Immunantwort des Wirts sind. Diese Ergebnisse erweitern das Verständnis molekularer Details der Pathogen-Wirt-Interaktion zwischen P. larvae und der Honigbienenlarve.