Sperma-induzierte Bildung neutrophiler extrazellulärer Traps (NETs) im bovinen System

Während der künstlichen Besamung des Rindes kommt es zum Einbringen von Spermien, Seminalplasma und Verdünnerbestandteilen in den Uterus, einer Region, in welche diese Bestandteile natürlicherweise nicht verbracht werden. Basierend auf polymorphkernigen mononukleären Neutrophilen (PMN) führt das Einbringen der Spermien während der (künstlichen) Besamung zu einer schnellen Reaktion des angeborenen Immunsystems. Ein Haupteffektormechanismus dieser Immunzellpopulation ist die Bildung neutrophiler extrazellulärer Traps (NETs, NETose). Hierbei handelt es sich um spinnennetzähnliche Strukturen, welche dem Abfangen von Pathogenen dienen. Kürzlich wurde NETose auch als Reaktion auf humane und bovine Spermien beschrieben.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit Interaktionen boviner PMN mit verschiedenen Spermaaufbereitungen sowie deren molekularen Grundlagen in vitro. Die Konfrontation von PMN mit Spermien resultierte in einer schnellen, dosisabhängigen NET-Bildung. Mikroskopische Untersuchungen wiesen verschiedene Phänotypen (spread, aggregated und diffuse NETs) nach und belegten die Präsenz charakteristischer NET-Komponenten wie Histonen, neutrophiler Elastase (NE) und Pentraxin. Funktionelle Experimente zur Inhibition boviner Sperma-induzierter NETose zeigten, dass es sich um einen NADPH-Oxidase (NOX)- und Peptidylarginine Deiminase 4 (PAD4)-abhängigen Prozess handelt, welcher weiterhin auf das Vorhandensein intra- und extrazellulärem Kalziums angewiesen ist. Andererseits konnte keine Abhängigkeit von ERK1/2- und PI3K-vermittelten Signalwegen nachgewiesen werden. Auch die Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität schien keinen wesentlichen Einfluss auf die NET-Bildung zu haben. Es erscheint interessant, dass sowohl gereinigte Spermien als auch die gesamte Spermiensuspension oder der Überstand (nach Entfernung der Spermien) NETose induzierten, wobei insgesamt die Reaktion bei Ersteren am schwächsten ausfiel. Erhöhter Sauerstoffverbrauch und verstärkte Protonenabgabe als Zeichen der PMN-Aktivierung konnten hingegen nur bei Verwendung von Sperma-Überstand nachgewiesen werden. Frische Spermaaufbereitungen induzierten eine stärkere NETose als tiefgefroren-aufgetaute. Die Beweglichkeit der Spermien hatte jedoch keinen Einfluss auf das Ausmaß der NETose. Weiterhin wurde NETose als Reaktion der PMN auf verschiedene Spermaverdünner und unterschiedliche Seminalplasma-konzentrationen sowohl junger als auch erwachsener Bullen sowie gesexte und nicht-gesexte Spermien untersucht. Es wurden drei verschiedene Verdünner von je zwei Firmen in frischem und tiefgefroren-aufgetautem Zustand verglichen. Die Reaktionen unterschieden sich zwischen den Verdünnern der zwei Firmen. Eigelb konnte dabei nicht per se als stärkster Auslöser der NETose ausgemacht werden. Die NET-Bildung hing außerdem stark von der Anwesenheit und Konzentration des Seminalplasmas ab. Dieses führte bereits bei niedrigen Konzentrationen von 1 % zur NETose. Zudem induzierte das Seminalplasma junger Bullen eine stärkere NET-Bildung als das erwachsener Bullen. Sex-Sorting der Spermien hatte indes keinen Einfluss auf das Ausmaß der NETose.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass bovine Spermiensuspensionen, welche in vitro mit PMN konfrontiert werden, NETose induzieren, wobei die Reaktion im Großen und Ganzen klassischen Signalwegen folgt. Überraschenderweise führen verschiedene Komponenten der Besamungsportion auch ohne Beteiligung von Samenzellen zu NETose. Aufgrund der Daten der vorliegenden Arbeit vermuten wir, dass Spermien-induzierte NETose auch in vivo während der künstlichen Besamung stattfinden und mit reduzierter Fruchtbarkeit in Zusammenhang stehen könnte. Es bedarf jedoch weiterer Untersuchungen, um die Rolle der bovinen Spermien-induzierten NETose in vivo zu klären.
 
During artificial insemination in cattle, sperm cells as well as seminal plasma and diluent/extender are transferred into the uterus, a location where they are not found naturally. The deposition of sperm during (artificial) insemination results in an early host innate immune reaction mainly based on polymorphonuclear neutrophils (PMN). One major effector mechanism is the formation of neutrophil extracellular traps (NETs, NETosis), a spiderweb-like structure to entrap pathogens. NETosis was recently reported to be induced by spermatozoa in humans and cattle.
In this work, we investigated interactions of bovine PMN with different semen-derived samples in vitro and analyzed the molecular aspects of this effector mechanism. Confronting of PMN with sperm cell preparations resulted in a rapid and dose-dependent NET formation. Microscopic analyses revealed different phenotypes of NETs (spread, aggregated and diffuse NETs) and the presence of characteristic components of NET structures, such as histones, neutrophil elastase (NE) and pentraxin. Functional inhibition experiments revealed sperm-triggered NETosis as a NADPH oxidase (NOX)- and peptidylarginine deiminase 4 (PAD4)-dependent process and proved it to be dependent on intra- and extracellular Ca++ influxes whilst myeloperoxidase (MPO) activity and ERK1/2- and PI3K-related signaling pathways did not seem to play a pivotal role in this effector mechanism.
As an interesting finding, all sperm-derived fractions, i. e. purified sperm cells as well as sperm cell preparations or supernatant in principle, induced NETosis, although purified sperm cells had the lowest effects. Enhanced levels of oxygen consumption and proton leak in PMN revealed sperm supernatants but not purified sperm cells as PMN activators. Fresh sperm cell preparations induced NETosis stronger than frozen-thawed ones. The level of NETosis was not related to spermatozoa viability.
Furthermore, we investigated interactions between bovine PMN and different semen extenders, various seminal plasma concentrations from young and old bulls as well as sexed and non-sexed semen. We compared three different semen extenders from two companies in fresh and frozen-thawed conditions. The reaction differed between the extenders of the two companies, and egg yolk was not per se the strongest NET inducer. Sperm-PMN binding also depended on the presence of seminal plasma since seminal plasma alone, even at low concentrations of 1 %, induced NETosis. Seminal plasma from young bulls led to significantly higher NET induction than that of old ones. We observed no difference between non-sex-sorted and sex-sorted sperm and its extenders.
In summary, we demonstrated that bovine PMN confronted with sperm cells form NETs in vitro. Overall, bovine sperm-induced NETosis follows classical signaling pathways. Surprisingly, components of insemination doses other than sperm cells also triggered the formation of NETs. These findings indicate that sperm-derived NETosis might occur in vivo during artificial insemination and may therefore play a role in reduced fertility. Consequently, more effort is needed to evaluate the role of bovine sperm-induced NETosis in vivo.