Entwicklung eines Multiplex-Diagnostikverfahrens zur Detektion von caninen vektorübertragenen Krankheitserregern

Die Weiterentwicklung von Diagnostikmethoden und die Generierung epidemiologischer Daten sind im Zusammenhang mit caninen vektorübertragenen Erkrankungen wichtige Voraussetzungen, um Infektionsrisiken einzuschätzen, geeignete Prophylaxe- und Therapiemaßnahmen zu ergreifen und somit die Verbreitung dieser Krankheitserreger einzudämmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals eine Triplex-PCR zur simultanen Detektion von caninen vektorübertragenen Erregern der Familie Onchocercidae sowie Anaplasmataceae und der Ordnung Piroplasmida entwickelt. Darauf aufbauend wurde mit der Etablierung einer Multiplex-Diagnostikmethode auf Basis der Luminex®-xMAP®-Technologie begonnen. Diese sollte zur Speziesdifferenzierung der Erreger dienen, die mit der Multiplex-PCR nachgewiesen wurden. In diesem Projekt lag der Fokus auf der Differenzierung der caninen Pathogene Babesia canis, Babesia vogeli, Babesia gibsoni, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, Candidatus Neoehrlichia mikurensis, Rickettsia conorii und Dirofilaria immitis. Der Versuch die Triplex-PCR mit einem zusätzlichen Primerpaar zum Nachweis von Rickettsia spp. auf ein Quadruplex-Verfahren zu erweitern, wurde abgebrochen, da die Methode im Vergleich zur Triplex-PCR weniger zuverlässige Ergebnisse liefern konnte. Im Rahmen der Entwicklung der genannten Diagnostikmethoden wurden 246 Blutproben von Hunden aus den Ländern Ungarn, Griechenland, Mazedonien, Bosnien-Herzegowina und Israel gesammelt und zum vereinfachten Transport sowie zur Konservierung auf FTA®-Karten archiviert. Zur Probengewinnung wurden Länder gewählt, in denen die ausgewählten Erreger endemisch sind. Die Beprobung wurde vor Ort bei Hunden durchgeführt, bei denen der Verdacht auf eine Infektion mit einem der hier relevanten Krankheitserreger bestand. Mittels eines DNAExtraktionsverfahrens wurden die Nukleinsäuren aus der Matrix des FTA®-Papiers isoliert und mit der Triplex-PCR sowie teilweise mit der Quadruplex-PCR untersucht. Aufgrund der Diskrepanz zwischen den Ergebnissen der beiden Verfahren sowie der scheinbar geringeren Sensitivität und Spezifität der Quadruplex-PCR im Vergleich zur Triplex-PCR wurde die Quadruplex-PCR ausschließlich bei 204 der 246 Proben angewandt. Die Blutproben aus Israel waren ausschließlich zur Verwendung im Etablierungsprozess der Diagnostikverfahren vorgesehen, da sie von Hunden stammten, die zum Beprobungszeitpunkt bereits mit vektorübertragenen Erkrankungen diagnostiziert waren.
Das speziesspezifische Multiplex-Diagnostikverfahren auf Basis der Luminex®-xMAP®-Technologie konnte in dem gegebenen Zeitrahmen nicht vollständig etabliert werden. Nach Durchführung einiger Modifikationen hinsichtlich der Kopplungs- und Hybridisierungsverfahren, wäre jedoch ein sensitiver und spezifischer Nachweis der hier ausgewählten Pathogene sowie eine Erweiterung des Assays auf weitere Erreger, basierend auf der beschriebenen Triplex-PCR, möglich.