Identification of ß-tubulin Isotypes and Development of Pyrosequencing Assays for Benzimidazole Resistance in Heterakis gallinarum and Ascaridia galli

Poultry is considered to be one of the best sources of high quality protein for humans. Following recent changes in husbandry systems for poultry in Europe from cage to other, alternative husbandry systems such as free-range systems, increased prevalence of helminth infections, predominantly Ascaridia galli and Heterakis gallinarum, was observed. The basic principles for the effective control of helminth infections in poultry farms are a combination of preventive measures such as biosecurity and disinfection with broad-spectrum anthelmintic therapy. The benzimidazoles (BZs) flubendazole and fenbendazole have been certified for treatment of chicken nematodes within the European Union and are widely used as save broad-spectrum anthelmintics in poultry. Benzimidazole (BZ)-resistance is widespread and a significant problem in several parasitic nematodes of ruminants and horses and was correlated with the presence of three single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the ß-tubulin isotype 1 gene of strongyle nematodes. However, BZ-resistance has so far not been reported in the chicken parasitic nematodes but the risk for resistance development has to be considered as existant and will increase with parasite infection intensity and treatment frequencies. Therefore, it is necessary to establish sensitive and reliable diagnostic tests for detection of BZ-resistance at least for the most important nematodes of chicken. Single nucleotide polymorphisms in the ß-tubulin gene, particularly at the three specific codons F200Y, E198A and F200Y, are used as markers for the molecular detection of BZ-resistance in-several strongyle nematodes in veterinary medicine. Among the molecular tests, pyrosequencing is considered an excellent technique for quantification of BZ-resistance associated ß-tubulin alleles even when the allele frequency is still quite low. Here, partial cDNAs representing a single ß-tubulin isotype were obtained using degenerated primers. The obtained nine A. galli sequences were 100% identical to a previously published sequence while the 40 new H. gallinarum sequences were 93-99% identical to each other and 88% identical to the A. galli sequence. The 1497 bp full-length ß-tubulin isotype 1 cDNA sequence with an 1353 bp open reading frame of poultry the nematode H. gallinarum was identified using 3'/5' RACE protocols. Phylogenetic maximum-likelihood analysis revealed that both A. galli and H. gallinarum ß-tubulin cDNAs cluster together with high statistical support values and share a close phylogenetic relationship with the other ascarid nematode ß-tubulins. Overall, there is a clear separation between ß-tubulins from clade V and clade III nematodes. The latter form a highly supported group. This together with the fact that in both clusters several ß-tubulin paralogs are found per species prevents to identify clear one-to-one orthologs between the ascarid ß-tubulins and those of Caenorhabditis elegans and strongyles. Even worse, such one-to-one orthologs cannot even be identified in comparison to the pig roundworm A. suum since the sister group in the phylogenetic tree to the A. galli and H. gallinarum group contains A. suum tbb-1 and tbb-2 cDNAs. Pyrosequencing assays for the quantitative analysis of potentially BZ-resistance associated SNPs in the ß-tubulin isotype 1 genes of A. galli and H. gallinarum were successfully developed. Plasmids with artificially synthesised inserts carrying combinations of SNPs were combined in defined ratios to evaluate sensitivity and linearity of the assays. The correlation of calculated and observed frequencies for the SNP determination at codons F167Y, E198A and F200Y was very high. Pyrosequencing assays carried out for A. galli collected from naturally infected chicken on Swedish farms showed no evidence for increased frequencies of potentially BZ-resistance associated SNPs. The developed assays offer the tools to screen for the presence and to quantify the relative frequency of BZresistance associated SNPs in populations of important poultry parasites. The assays have the potential of detecting the development of resistance in an early phase before it becomes clinically apparent. This offers the chance to implement measures to counteract further selection before resistance becomes widespread.
 
"Identifizierung von ß-Tubulin Isotypen und Entwicklung von Pyrosequenzierungs-Assays für die Analyse von Benzimidazole-Resistenz bei Heterakis gallinarum und Ascaridia galli"

Geflügel wird als eine der besten tierischen Proteinquellen für Menschen angesehen. Nach kürzlichen Änderungen in den Haltungssystemen für Geflügel in Europa von Käfig- zu alternativen Haltungsformen wie Freilandhaltung, wurden erhöhte Prävalenzen von Infektionen mit Helminthen, insbesondere Ascaridia galli und Heterakis gallinarum, beobachtet. Die grundlegenden Prinzipien für eine effektive Kontrolle von Helmintheninfektionen beim Geflügel vereinen eine Kombination von präventiven Maßnahmen wie Biosicherheit und Desinfektion mit der Anwendung von Breitspektrum-Anthelminthika. Die Benzimidazole Flubendazol und Fenbendazol wurden für die Behandlung von Hühnernematoden in der Europäischen Union zertifiziert und werden weithin als sichere Breitspektrum-Anthelminthika beim Geflügel eingesetzt. Benzimidazol(BZ)-Resistenz ist ein weit verbreitetes und bedeutendes Problem bei zahlreichen parasitischen Nematoden von Wiederkäuern und Pferden und wurde insbesondere mit dem Vorhandensein von drei Einzelnukleotidpolymorphismen (engl. Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) im ß-Tubulin Isotyp 1 Gen von Strongyliden korreliert. Benzimidazol-Resistenz wurde jedoch bisher nicht für parasitische Nematoden der Hühner beschrieben. Grundsätzlich ist allerdings das Risiko für die Entwicklung von BZ-Resistenz bei Geflügelnematoden als gegeben einzuschätzen und wird mit erhöhter Infektionsintensität und Behandlungsfrequenz steigen. Daher ist es notwendig, sensitive und zuverlässige diagnostische Tests für die Detektion von BZ-Resistenz zumindest für die wichtigsten Nematoden der Hühner zu etablieren. Einzelnukleotidpolymorphismen im ß-Tubulin Isotyp 1 Gen, insbesondere in den drei spezifischen Codons F200Y, E198A und F200Y, werden in der Veterinärmedizin als Marker zur Detektion von BZ-Resistenz in einigen Strongylidenspezies verwendet. Von den verfügbaren molekularen Verfahren wird Pyrosequenzierung als eine exzellente Technik für die Quantifizierung von mit BZ-Resistenz assoziierten ß-Tubulinallelen angesehen, selbst wenn die Häufigkeit dieser Allele noch gering ist. Hier wurden partielle cDNAs eines bestimmten ß-Tubulinisotyps mit Hilfe degenerierter Primer erhalten. Die neun gewonnenen A. galli cDNASequenzen waren 100 % identisch untereinander und zu einer zuvor publizierten Sequenz während die 40 neuen H. gallinarum 93-99% identisch untereinander und 88% identisch zu der A. galli Sequenz waren. Es wurde eine 1497 bp umfassende, vollständige ß-Tubulin Isotyp 1 cDNASequenz mit einem offenen Leseraster von 1353 bp des Geflügel Nematoden H. gallinarum identifiziert. Eine phylogenetische Maximum-Likelihood Analyse zeigte, dass die beiden A. galli und H. gallinarum ß-Tubulin cDNAs zusammen eine Gruppe bildeten und die gleiche phylogenetische Beziehung zu den anderen ß-Tubulinen aus Ascariden aufweisen. Insgesamt ergab sich eine klare Aufteilung zwischen ß-Tubulinen von Klade V- und Klade III-Nematoden. Die letzteren formten eine Gruppe mit hoher statistischer Unterstützung. Dies, zusammen mit der Tatsache, dass in beiden Gruppen mehrere Paraloge je Spezies gefunden wurden, verhindert die Identifizierung von eins-zu-eins Orthologen zwischen den ß-Tubulinen von Ascariden und denen von Caenorhabditis elegans sowie denen der weiteren Strongylidenspezies. Zudem können solche eins-zu-eins Orthologe auch nicht im Vergleich zum Schweinespulwurm Ascaris suum identifiziert werden, denn die Schwestergruppe im phylogenetischen Baum zu der Gruppe aus A. galli und H. gallinarum enthält die A. suum tbb-1 und tbb-2 cDNAs. Pyrosequenzierungsassays für die quantitative Analyse der potentiell mit BZ-Resistenz assoziierten SNPs in den ß-Tubulin Isotyp 1-Genen von A. galli und H. gallinarum wurden erfolgreich entwickelt. Plasmide mit artifiziell synthetisierten Insertionen wurden in definierten Verhältnissen gemischt, um die Sensitivität und Linearität der Assays zu evaluieren. Die Korrelation zwischen berechneter und gemessener Frequenz für die Bestimmung der SNPs in den Codons F167Y, E198A und F200Y war sehr hoch. Pyrosequenzierungsassays, die mit A. galli aus natürlich infizierten Hühnern von schwedischen Farmen durchgeführt wurden, ergaben keinen Nachweis für erhöhte Häufigkeiten von mit BZ-Resistenz assozierten ß-Tubulin SNPs. Die entwickelten Assays erlauben es, die Entwicklung von Resistenz schon in einer frühen Phase nachzuweisen, bevor die Resistenz klinisch sichtbar wird. Dies eröffnet die Chance Maßnahmen zu implementieren, die einer weiteren Resistenzentwicklung entgegenwirken.