Die Analyse retikulierter Thrombozyten des Hundes mit dem Hämatologiegerät ProCyte Dx im Vergleich zur durchflusszytometrischen Bestimmung

Ziel der Studie
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Methodenvalidierung der Messung der retikulierten Thrombozyten als Marker der thrombozytären Regeneration am ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Inc., USA) aus Vollblutproben des Hundes im direkten Vergleich zur durchflusszytometrischen Analyse als Referenzmethode. Ein weiteres Ziel war die Überprüfung der Präzision sowie die Erstellung eines Referenzintervalles für diesen neuen Parameter.
Material und Methoden
Für den Methodenvergleich wurden in einem Zeitraum von März 2017 bis November 2017 prospektiv EDTA-Vollblutproben von 56 Hunden analysiert. Dabei wurden sowohl gesunde Hunde, als auch Patienten mit Thrombozytopenie gemessen, bei denen hohe Werte der retikulierten Thrombozyten zu erwarten waren. Ausschlusskriterien waren einerseits das Vorliegen von Thrombozytenaggregaten Grad 2-4 (von 0-4) nach semiquantitativer Beurteilung des Blutausstriches sowie fehlerhafte oder nicht auswertbare Analysen am Durchflusszytometer. Letzere traten z. B. bei Verschmutzung des Waschpuffers, unspezifischer Bindung der Antikörper oder bei Vorliegen von markierten Events, die außerhalb der für Thrombozyten spezifischen Position im Scattergramm lagen, auf. Somit konnten 42 von 56 Messungen für den Methodenvergleich eingeschlossen werden. Die Bestimmung der prozentualen Werte der retikulierten Thrombozyten erfolgte durch Setzen eines Gates im optischen Messkanal der Thrombozyten, mit der geräteeigenen Software des ProCyte Dxs. Im Anschluss erfolgte eine Messung am Durchflusszytometer unter Verwendung von CD61-Antikörpern, mit denen eine Markierung der Thrombozyten ermöglicht wurde und gleichzeitiger Darstellung des RNA-Gehalts durch den Einsatz von Thiazolorange. Bei beiden Geräten wurde die Präzision unter Berechnung des intra-assay Variationskoeffzienten aus einer zehnfachen Wiederholungsmessung ermittelt. Die statistische Auswertung des Methodenvergleiches erfolgte durch Berechnung des Spearman-Korrelationskoeffizienten, einer Bland-Altman-Analyse sowie einer Passing-Bablok-Regressionsanalyse.
Dabei kamen das Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft Excel 2016 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) und die statistische Software MedCalc® Version 17.8.6 (MedCalc Software Ltd, Ostende, Belgien) zum Einsatz.
Für die Erstellung eines Referenzintervalls konnten Messungen von 120 gesunden adulten Hunden (Alter zwischen 1 Jahr und 14 Jahren) eingeschlossen werden. Die Berechnung erfolgte mit Hilfe des Reference Value Advisor Version 2.1 (Biostatistiques, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, Frankreich). Hier kam die nichtparametrische Methode zum Einsatz.
Ergebnisse
Der Spearman-Korrelationskoeffizient (rs) zeigte mit einem Wert von 0,70 eine moderate Korrelation der beiden Messmethoden an. Dabei fiel in der Bland-Altman-Analyse ein mittlerer negativer proportionaler Bias von -8,2 % des ProCyte Dx im Vergleich zur Durchflusszytometrie auf. Hinsichtlich der Präzision lag der intra-assay Variationskoeffizient in einer Probe mit vergleichsweise niedrigen Werten der retikulierten Thrombozyten (Mittelwert 2,8 %) bei 32,89 % für den ProCyte Dx und bei 12,85 % für die durchflusszytometrische Analyse. Bei Analyse eines Patienten mit Thrombozytopenie und hohen Werten der retikulierten Thrombozyten (Mittelwert 31,6 %) hingegen zeigte der ProCyte Dx einen deutlich niedrigeren Variationskoeffizienten von lediglich 7,52 %.
Das 95%-Referenzintervall der Messung retikulierter Thrombozyten am ProCyte Dx lag bei 0-7,47 %.
Schlussfolgerung
Der ProCyte Dx ist in der Lage die retikulierten Thrombozyten des Hundes zu bestimmen. Im Vergleich zum Durchflusszytometer zeigt sich eine akzeptable, allerdings keine herausragende Korrelation sowie das Vorliegen eines Bias, was anhand der unterschiedlichen Methodik der Messgeräte allerdings nicht überrascht. Zudem konnten hier lediglich 42 Vergleichsmessungen durchgeführt werden, was als Limitation der Studie zu sehen ist, da eine breitere Verteilungsspanne der Messergebnisse wünschenswert gewesen wäre.
Mit Hilfe der neu erstellten Referenzintervalle können erhöhte Werte bei Patienten mit Thrombozytopenie detektiert werden, welche ein Hinweis auf eine aktive Megakaryopoese sind und somit von klinischer Relevanz sind. Die klinische Überprüfung des Parameters am ProCyte Dx bei Patienten mit Thrombozytopenie könnte Gegenstand zukünftiger Studien sein.
Die Etablierung der Messung durch den ProCyte Dx als Point-of-care Analyzer bietet den Vorteil, dass der Parameter in Zukunft auch für kleinere Praxen zugänglich sein könnte. Bei gesunden Patienten mit niedrigen Werten der retikulierten Thrombozyten ist jedoch eine gewisse Messungenauigkeit in Kauf zu nehmen, wohingegen die Wiederholbarkeit bei erhöhten Werten und somit klinisch relevanten Bereichen zufriedenstellende Ergebnisse erzielt.
 
Objective
The aim of this study was the method validation of whole blood analysis of reticulated platelets as marker of platelet regeneration with the ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Inc., USA) in comparison with flow cytometric analysis as reference method. In addition, repeatability was investigated and reference intervals were determined for this novel parameter on the ProCyte Dx.
Material and methods
56 blood samples of dogs were prospectively analyzed between March 2017 and November 2017 for the method comparison study. Samples were obtained from healthy dogs as well as patients with thrombocytopenia, which were expected to have increased numbers of reticulated platelets. Exclusion criteria were the presence of moderate to high numbers of platelet aggregates grade 2-4 (of 0-4) by semiquantitative estimate on blood smear evaluation or invalid flow cytometric analysis. Flow cytometric analysis was considered invalid due to contamination of the washing buffer, unspecific binding of antibodies or when high numbers of events bound to antibodies were lacking the platelet specific light scatter properties. Exclusion of 14/56 samples resulted in 42 blood samples included for method comparison study. The population of reticulated platelets was detected by manual gating strategy in the optical channel of the ProCyte Dx using the manufacturer´s software. Flow cytometric measurement was performed with a dual labelling protocol. CD61 antibodies were used to detect platelets in whole blood and thiazole orange stained RNA-content in this population. Intra assay precision was evaluated in ten replicate measurements for both methods. Statistical analysis included determination of Spearman's rank correlation coefficient, Bland-Altman analysis and a Passing-Bablok regression analysis.
Microsoft excel 2016 (Microsoft corporation, Redmond, WA, USA) and the statistical software MedCalc® version 17.8.6 (MedCalc Software Ltd, Ostende, Belgium) were used for analysis of data.
For establishment of reference intervals, measurements of 120 healthy adult dogs (age between 1 and 14 years) were included. The nonparametric method was performed with the software Reference Value Advisor version 2.1 (Biostatistiques, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, France).
Results
There was a fair correlation for reticulated platelet percentages between the two methods with a spearman rank's correlation coefficient (rs) of 0.70. Bland-Altman analysis revealed a mean negative proportional bias of -8.2 % for the ProCyte Dx. Intra-assay CV in a sample with low percentages of reticulated platelets (mean 2.8 %) was 12.85 % for flow cytometry and 32.89 % for the ProCyte Dx. In a patient with thrombocytopenia and high values of reticulated platelets (mean 31.6 %), a lower intra-assay CV of 7.52 % was seen for the ProCyte Dx. The reference interval for the percentage of r-PLT ranged from 0 to 7.47 %.
Conclusion
The ProCyte Dx is capable to reliably detect reticulated platelets in blood samples of dogs. Compared to flow cytometry, there was an acceptable, but not a perfect correlation and a proportional bias. However, this is not surprising as the analyzers work with different methods. The low number of only 42 included samples is also a limitation as a broader range of measurements is preferable.
The novel reference interval might be an aid to detect increased values of reticulated platelets in patients with thrombocytopenia that hints towards active megakaryopoiesis. The clinical value of this novel parameter with the ProCyte Dx could be investigated in future studies.
The measurement of reticulated platelets with the ProCyte Dx as a point-of-care analyzer offers a new possibility for clinicians in small medical practices to use this parameter. In healthy dogs with low values of reticulated platelets, a certain degree of imprecision has to be taken into account. However, in more clinically relevant elevated values, intra-assay precision is satisfactory.