Julia Möllerberndt
Zytokine im equinen Thrombozytenlysat und deren Wechselwirkungen mit mesenchymalen Stromazellen
Schlüsselwörter: Zytokine, Thrombozytenlysat, mesenchymale Stromazellen, Priming
Einleitung:
In der Pferdemedizin werden regenerative Therapeutika, insbesondere orthobiologische Produkte wie Thrombozytenlysat (PL) oder mesenchymale Stromazellen (MSC), zur Therapie verschiedener Erkrankungen eingesetzt.
PL kann zudem als Mediumzusatz zur Kultivierung von MSC genutzt werden, was den Einsatz von fetalem bovinem Serum (FBS) ersetzt. Bekannt ist, dass PL viele Wachstumsfaktoren enthält, die die MSC positiv beeinflussen können. Allerdings liegen bislang, auch speziesübergreifend, nur unzureichende Kenntnisse über das Vorkommen von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen im PL sowie über ihren Einfluss auf die immunmodulatorischen Fähigkeiten der MSC vor.
Ziele:
Das Ziel der ersten Studie war es zu ermitteln, ob und in welcher Konzentration equines Buffy-Coat-basiertes PL Zytokine enthält. Mit der Kenntnis über den Zytokingehalt des PL sollte in der zweiten Studie untersucht werden, ob PL die immunmodulatorischen Charakteristika der MSC beeinflusst.
Material und Methoden:
In der ersten Studie wurden Plasma, Serum, Thrombozytenkonzentrat und Thrombozytenlysat von 20 Spendertieren (Genehmigung: Regierungspräsidium Gießen, A14/2019) hinsichtlich ihrer Zytokingehalte mittels ELISA untersucht. Die Konzentrationen wurden von antiinflammatorischen Zytokinen (IL-10 und IL-4) und von inflammatorischen Zytokinen (IFN-?, TNF-a, IL-1ß und IL-6) gemessen. Außerdem wurden von allen Spendern eine Hämatologie und Blutchemie angefertigt.
In der zweiten Studie wurden MSC von fünf Spendern (Regierungspräsidium Gießen, V54-19c2015h0GI18/13 kTV 4/2019) mit gepooltem PL, dem herkömmlich genutzten FBS, FBS + IFN-? oder FBS + IL-10 kultiviert. Um die Eigenschaften der MSC in einem entzündlichen Milieu zu untersuchen, wurden Co-Kulturen mit aktivierten PBMC eines Spenders (Genehmigung: Regierungspräsidium Gießen, A17/2018) angesetzt und in den verschiedenen Mediumansätzen verglichen. Nach der Kultivierung wurden in den Überständen der Kulturansätze mittels ELISA die Konzentrationen von IL-10, IFN-?, TNF-a und IL-1ß bestimmt. Die kultivierten MSC wurden mittels qRT-PCR auf Expression der immunregulatorischen Gene TNFAIP6, COX2, VCAM1, IDO1, CXCR4, HIF1A, NOS2 und MHC2 untersucht. Die Proliferation der PBMC wurde mittels MTS Assay und Durchflusszytometrie analysiert. Der Anteil an FoxP3+ Zellen wurde ebenfalls mittels Durchflusszytometrie gemessen.
Ergebnisse:
Die Konzentrationen aller gemessenen Zytokine waren für jeden Spender individuell betrachtet in den verschiedenen Blutprodukten ähnlich und korrelierten zwischen Serum, Plasma und Thrombozytenkonzentrat stark, zu PL moderat. Beim Vergleich der Spender gab es starke interindividuelle Schwankungen in den Zytokingehalten. Vier Pferde zeigten sehr hohe Zytokingehalte und gleichzeitig erhöhte Werte der blutchemischen Parameter Alkalische Phosphatase, Kreatinin und/oder Laktatdehydrogenase.
Die Zytokinmessungen der Zellkulturüberstände ergaben, dass das PL-Medium auch nach der Inkubationszeit noch annähernd die Ausgangskonzentrationen von IFN-? und IL-10 enthielt. Im Gegensatz dazu konnte keines der Zytokine im FBS-Kontrollmedium nachgewiesen werden. Dementsprechend unterschieden sich die Zytokinkonzentrationen in PBMC- und Co-Kulturüberständen signifikant zwischen PL- und FBS-Medien, mit Ausnahme von IL-1ß. Die analogen Unterschiede waren nicht signifikant für MSC-Überstände, die im Vergleich zu PBMC und Co-Kulturen insgesamt niedrigere Konzentrationen an Zytokinen enthielten.
Die Stimulation der MSC durch aktivierte PBMC in Co-Kultur oder durch PL als Mediumzusatz führte zu einer veränderten Genexpression. Durch die Co-Kultur wurde die Expression von COX2, TNFAIP6, IDO1, CXCR4 und MHC2 hochreguliert, sowie VCAM1 runterreguliert. Die MSC alleine, kultiviert in PL, zeigten eine vermehrte Expression von COX2, TNFAIP6, CXCR4 und HIF1A im Vergleich zu MSC in FBS-Medien.
Die MSC hemmten die Proliferation bzw. metabolische Aktivität der PBMC, was jedoch nur in FBS + IFN-? und FBS + IL-10 Medien signifikant war, nicht aber in PL-Medium. Die verschiedenen Kultivierungsansätze ergaben keine Unterschiede im Anteil von FoxP3+ PBMC.
Schlussfolgerung:
Buffy-Coat-basiertes equines PL enthält je nach Spendertier unterschiedliche Konzentrationen verschiedener Zytokine, wobei die Blutchemie einen prädiktiven Wert für die Zytokingehalte haben könnte. Das PL als MSC-Kultursupplement fördert die Expression immunregulatorischer Gene, wobei die funktionellen Konsequenzen weiterer Untersuchungen bedürfen.
