Metabolic Network Analysis of the Cell Factory Aspergillus niger

In der vorliegenden Arbeit wird ein systembiologischer Ansatz vorgestellt, der mit Hilfe von Computersimulationen potentielle genetische Targets und optimale metabolische Wege zur Proteinproduktion in metabolischen Netzwerken vorhersagt, und somit einen wichtigen Beitrag zur rationalen Stammoptimierung von Mikroorganismen liefert. Hierfür wurde für Aspergillus niger ein auf dem annotierten Genom basierendes metabolisches Modell des zentralen Kohlenstoffmetabolismus konstruiert, mit dem Elementarmoden-Analysen durchgeführt wurden. Durch Analyse von Korrelationen von Stoffflüssen zwischen Stoffwechselenzymen konnte hierbei ein neuer Ansatz zum Design von Zellfabriken entwickelt werden, der erstmals die in silico Vorhersage von Deletions- und Amplifikationstargets ermöglicht und damit eine wichtige Voraussetzung zur rationalen Stammoptimierung liefert. Die simulierte Produktion verschiedener Zielprodukte unter variierenden Medienbedingungen ergab, dass für die Identifizierung von Targets die Unterscheidung biologischer Zustände - die wachstumsassoziierte und wachstumsunabhängige Produktion - wichtig ist. Zu den vom metabolischen Zustand unabhängigen Targets zählen ausschließlich die biochemischen Wege der Protein-Glykosylierung und der Produktbiosynthese. Zu den wachstumsassoziierten Targets gehören unter anderen der Pentose-Phosphat Weg (Amplifikationstargets) und die Reaktionen des Citratzyklus (Attenuationstargets). Die Ergebnisse dieses systembiologischen Ansatzes konnten durch enzymkinetische Studien und Analysen der intrazellulären metabolischen Stoffflüsse mittels Metaboliten-Bilanzierung und kontinuierlicher Kultivierungen validiert werden. Des Weiteren wurden die in silico Analysen auf verschiedene industriell relevante Wirtssysteme angewendet und wesentliche Unterschiede im Hinblick auf die genetischen Targets herausgearbeitet. Vergleiche mit experimentellen Arbeiten aus der rationalen Stammentwicklung von Corynebacterium glutamicum zur Lysin-Produktion unterstützen die Anwendbarkeit dieser neuen in silico Analyse. Description In the present work, a systems biology approach is presented, which enables the prediction of potential genetic targets and optimal pathways for protein production within a metabolic network, and thus, makes an important contribution to the rational strain optimization of micro-organisms. For this, elementary flux modes analysis was carried out using a metabolic model of Aspergillus niger, which was condensed from the genome based metabolic model. Hereby, a new approach was developed for the design of cell factories by the analysis of metabolic flux correlations between metabolic enzymes. This allowed the in silico prediction of deletion and amplification targets and thus provides an important prerequisite for rational strain optimization. The network analysis was carried out using various target products under varying nutrient conditions. The approach revealed that the success of identification of genetic targets depends on the differentiation of biological states, the growth-associated or non-growth associated production of the target proteins. Only a few targets, such as the pathways of protein glycosylation and protein biosynthesis can be identified as independent of the biological state. The growth-associated targets include inter alia the pentose-phosphate pathway (amplification target) and the reactions of the tricarboxylic acid cycle (attenuation target). The results of this systems biology approach could be validated by enzyme kinetic studies and analyses of intracellular metabolic fluxes using metabolite balancing and continuous cultivations. In addition, metabolic networks of several industrially relevant hosts were investigated using this in silico approach and essential differences were elaborated. Comparisons with experimental studies for rational strain optimization of Corynebacterium glutamicum for lysine production support the applicability of this novel in silico approach.