Epidemiology and genetic diversity of lagomorph-infecting treponemes in Europe

Ziel dieser Arbeit war die Verbreitung und genetische Vielfalt von Lagomorph-infizierenden Treponemen in ganz Europa zu untersuchen. Treponemen sind gramnegative spiralförmige Bakterien, die ubiquitär in der Umwelt vorkommen, als Symbionten leben oder Krankheiten bei Menschen und Tieren verursachen können. Pathogene, nicht kultivierbare Treponemen sind morphologisch nicht unterscheidbar und umfassen das den Menschen infizierende Treponema pallidum, mit seinen Unterarten pallidum, pertenue und endemicum, T. carateum und T. paraluisleporidarum, welches Lagomorphen infiziert.
Die epidemiologische Untersuchung umfasste ein Screening auf Treponema-Antikörper oder eine quantitative PCR, falls keine Serumproben zur Verfügung standen. Die Proben stammten aus acht europäischen Ländern: Deutschland, Ungarn, Spanien, Italien, den Niederlanden, der Tschechischen Republik, dem Vereinigten Königreich und Schweden. Sie wurden entweder selbst gesammelt oder von Jägern und Mitarbeitern von Veterinäruntersuchungsämtern bereitgestellt. Die Probenentnahme umfasste die postmortale Blutentnahme aus dem Herzen, vaginale Abstriche bei weiblichen Tieren und die Entfernung des Penis bei männlichen Tieren. Bei Syphilis-typischen Läsionen (n = 20) wurde ebenfalls das entsprechende Material isoliert.
Als Erstes wurden alle Serumproben mit dem zum Screening geeigneten Treponema pallidum-Partikelagglutinationstest getestet, und das eine Auswahl von Proben anschließend mit dem spezifischen Fluoreszenz Treponemen Antikörper Absorptionstest bestätigt. Aufgrund der antigenen Kreuzreaktivität zwischen T. pallidum und T. paraluisleporidarum sind beide Tests auch zum Einsatz an Proben von Lagomorphen geeignet. DNA aus Gewebe- und Abstrichmaterial wurde mit dem QIAamp DNA Mini Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Für den Fall, dass keine Serumproben verfügbar waren, wurde eine sondenbasierte qPCR durchgeführt, die auf das Polymerase-I-Gen abzielte.
Zur Bestätigung der Wirtsspezies wurden bei zugesendete Proben zwei Regionen des Immunoglobin heavy chain-Gens (IGHGCH2 und IGHG-Hinge) sequenziert und mit veröffentlichten Daten verglichen. Die Multi-Locus-Sequenztypisierung umfasste die Amplifikation von zwei Treponemen-Genen: tp0488, das für das methyl-accepting chemotaxis-Protein 2 kodiert, und tp0548, das für ein hypothetisches Membranprotein kodiert. Die Gelelektrophorese identifizierte Amplikons der richtigen Größe (~830 bp für tp0488 und ~1070 bp für tp0548), die anschließend mit dem QIAquick Gel Extraction Kit extrahiert wurden. Die Sanger-Sequenzierung wurde vom Microsynth Laboratory durchgeführt. Um die mitochondrialen Genome (mt-Genome) zu generieren, wurden zwei Long-Range-PCRs von 95 zufällig ausgewählten Proben aus allen Probenahmestellen durchgeführt und die resultierenden DNA-Amplikons mit SPRISelect-Magnetkügelchen gereinigt. Die PCR-Produkte wurden gepoolt, fragmentiert und für die Illumina MiSeq-Sequenzierung vorbereitet. Die Sequenzdaten wurden mit dem 4Peaks Sequence Viewer und Geneious Prime ausgewertet, analysiert und abgeglichen, positiv selektierte Loci identifiziert und exkludiert. Die phylogenetischen Bäume wurden mithilfe von IQ Tree, MrBayes und Grape Tree Software generiert.
In allen Probenursprungsländern konnten Infektionen mit T. paraluisleporidarum nachgewiesen werden. Insgesamt wurden 1.230/2.729 Sera positiv getestet, während 182/287 Proben positive qPCR Ergebnisse erbrachten. Erwachsene Hasen waren signifikant häufiger seropositiv als Jungtiere, das Geschlecht der Tiere machte jedoch keinen Unterschied. Obwohl 8/11 Wild- und 3/5 Hauskaninchenproben Amplifikationen in der qPCR zeigten, konnten in keiner der Serumproben von Kaninchen aus Katalonien, Spanien, Antikörper nachgewiesen werden. Neben den bekannten Wirten Feldhase und Wildkaninchen wurden auch bei vier Schneehasen aus Schweden und zwei Korsikahasen aus Sizilien T. paraluisleporidarum- DNA nachgewiesen.
Die Multi-Locus-Sequenztypisierung ergab eine auffallend hohe genetische Diversität, die möglicherweise durch den positiven Selektionsdruck an beiden Loci erklärt werden kann. Während es sich bei den Unterschieden innerhalb des tp0488-Gens meist um Variationen einzelner Nukleotide handelte, umfasste die Variation innerhalb von tp0548 zwei hochvariable Regionen, die in humanpathogenen Spezies nicht vorkommen. Obwohl positiv selektierte Loci von der phylogenetischen Analyse ausgeschlossen wurden, konnte keine Clusterbildung nach geografischer Herkunft festgestellt werden. Die generierten mt-Genome sprechen für eine panmiktische Hasenpopulation in Mittel-/Westeuropa, die sich jedoch von griechischen und anatolischen Tieren unterscheidet. Nachfolgende Studien müssen effektive MLST-Loci erforschen, da tp0488 und tp0548 aufgrund des positiven Selektionsdruckes und folglich große genetische Variabilität ungeeignet sind. Die in dieser Arbeit beschriebene Beteiligung mehrerer Lagomorpha-Arten, das weite geografische Verbreitungsgebiet und die hohe genetische Vielfalt sprechen für einen endemischen Charakter von T. paraluisleporidarum in europäischen Lagomorphen.