Vorkommenshäufigkeit und pathophysiologische Faktoren der Thrombozytopenie bei Hunden mit portosystemischen Shunts

Hintergrund
Eine Thrombozytopenie ist die häufigste hämatologische Veränderung bei Menschen mit fortgeschrittener Hepatopathie und kann ebenso in der Veterinärmedizin bei Hunden mit chronischer Hepatopathie und Hunden mit PSS beobachtet werden. Eine multifaktorielle Genese wird bei der Entstehung von Thrombozytopenien in der Humanmedizin vermutet. In der Veterinärmedizin wurden mögliche Ursachen einer Thrombozytopenie bei Hunden mit PSS bislang nicht untersucht.

Ziel der Studie
Zielsetzung war eine Quantifizierung der Vorkommenshäufigkeit einer Thrombozytopenie und Identifizierung möglicher pathophysiologischer Faktoren einer Thrombozytopenie bei Hunden mit portosystemischen Shunts. Ferner sollte der Einfluss einer gastroprotektiven Therapie auf die Thrombozytenparameter und pathophysiologischer Faktoren evaluiert werden. Zusätzlich wurde die Thrombozytenzahl-Entwicklung im Zeitverlauf nach Eingriff bewertet.

Material und Methoden
Retrospektiv wurden labordiagnostische Parameter von 430 Hunden mit portosystemischen Shunts, welche im Zeitraum von 2009 bis 2019 in der Klinik für Kleintiere, Abteilung Innere Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen vorgestellt wurden, ausgewertet. Pathophysiologische Faktoren einer Thrombozytopenie wurden anhand ausgewählter labordiagnostischer Parameter in Bezug auf Thrombopoese, Leberfunktion, Inflammationsreaktion, Hyperkoagulabilität und gastrointestinale Blutungen in thrombozytopenischen Patienten und Patienten mit physiologischen Thrombozytenzahlen evaluiert. Labordiagnostische Parameter für gastrointestinale Blutungen wurden bei Patienten mit unterschiedlich stark ausgeprägten gastrointestinalen Symptomen betrachtet. Zusätzlich wurden Thrombozytenzahlen und pathophysiologische Faktoren unter dem Einfluss einer gastroprotektiven Therapie bewertet. Letztlich wurde der Verlauf der Thrombozytenzahlen nach chirurgischem bzw. interventionellem Verschluss bei Patienten mit kongenitalem portosystemischem Verschluss aufgezeigt und der Einfluss eines Restshunts auf die Entwicklung der Thrombozytenzahlen untersucht.

Ergebnisse
Eine Thrombozytopenie konnte bei 11,6 % der Patienten mit PSS festgestellt werden. Hunde mit multiplen PSS zeigten eine Thrombozytopenie in 25,4 % und damit statistisch signifikant häufiger (p < 0,001) als Hunde mit kongenitalen PSS. Hunde mit kongenitalem PSS wiesen eine Thrombozytopenie in 9,3 % der Fälle auf, wobei bei Hunden mit iPSS signifikant häufiger (p = 0,006) eine Thrombozytopenie (14,3 %) detektiert wurde als bei Hunden mit ePSS (4,7 %). In 84 % der thrombozytopenischen Patienten lag eine mild ausgeprägte Thrombozytopenie vor. In 25 % der Patienten, welche zur Diagnosestellung vorgestellt wurden, konnte eine Thrombozytopenie-auslösende Ursache detektiert werden. Die mittleren Thrombozyten¬zahlen lagen bei diesen Patienten mit 94 x 109/l niedriger als bei Patienten mit nicht detektierbarer Ursache einer Thrombozytopenie.
Bei Patienten mit physiologischen Thrombozytenzahlen aus den Gruppen iPSS und ePSS wurden statistisch signifikant höhere r PLT% (p = 0,024 und p = 0,013) als in der gesunden Kontrollgruppe detektiert. Bei Hunden mit iPSS (p < 0,001), ePSS (p = 0,033) und multiplen PSS (p = 0,002) und Thrombozytopenie konnten statistisch signifikant höhere r PLT% als bei Hunden mit physiologischen Thrombozytenzahlen dargestellt werden. Es konnte eine statistisch signifikante inverse Korrelation der Retikulozyten zu den Thrombozyten bei Patienten mit Thrombozytopenie detektiert werden (p = 0,006; rho = 0,404).

Anamnestisch lagen bei 130/430 Patienten (30,2 %) gastrointestinale Symptome und bei 19/430 Patienten (4,4 %) Hinweise auf gastrointestinale Blutungen vor. Patienten mit Hinweisen auf gastrointestinale Blutungen zeigten im Median niedrigere mittlere Thrombozytenzahlen von 191 x 109/l, höhere Retikulozyten, retikulierte Thrombo¬zytenzahlen und statistisch signifikant niedrigere Hämatokrit- und Hämoglobinwerte.
Patienten mit gastroprotektiver Therapie wiesen im Median höhere Thrombozytenzahlen (p = 0,002), niedrigere mittlere Konzentration an Harnstoff (p < 0,001) und höhere mittlere Konzentrationen an Albumin (p = 0,015) als Hunde ohne gastroprotektive Therapie auf. Patienten ohne gastroprotektive Therapie zeigen höhere mittlere CRP-Konzentrationen im Vergleich zu Patienten mit gastroprotektiver Therapie (p = 0,003 unter Einschluss einer antibakteriellen Therapie; p = 0,006 unter Ausschluss der Patienten mit antibakterieller Therapie).

Im Verlauf zeigten sich die Thrombozytenzahlen in der 12-Monatskontrolle signifikant höher als in der Blutuntersuchung vor Eingriff (p = 0,017). Die prozentualen und absoluten retikulierten Thrombozyten zeigten deskriptiv niedrigere Werte in der 12-Monatskontrolle (p = 0,148 und p = 0,761). Statistisch konnte kein signifikanter Unterschied in der Höhe der Thrombozytenzahlen in Abhängigkeit des Zeitpunktes oder Grad des Verschlusses (Restshunt versus Komplettverschluss) gesichert werden.

Schlussfolgerung
Eine Thrombozytopenie bei Hunden mit portosystemischen Shunts kann hinweisend auf die Schwere der Lebererkrankung sein. Eine Abklärung von Begleiterkrankungen wird bei Vorliegen von Thrombozytopenien empfohlen. Die Ursache der Thrombozytopenie lässt eine multifaktorielle Genese bei mäßig eingeschränkter Thrombopoese und erhöhtem Thrombzyten-Turnover vermuten. Gastrointestinale Blutungen könnten eine Ursache für niedrige Thrombozytenzahlen und einen erhöhten Thrombozyten-Turnover darstellen. Bei Patienten mit portosystemischen Shunts ist außerdem ein Zusammenhang der Thrombozytopenie zur Eisenmangelanämie denkbar. Eine unterschiedlich stark ausgeprägte Beteiligung einzelner pathophysiologischer Faktoren an einer Thrombozytopenie, abhängig von der Ätiologie der portosystemischen Shunts, ist denkbar. Eine gastroprotektive Therapie führt zu einer Minderung gastrointestinaler Symptome und zur Verbesserung labordiagnostischer Parameter.
 
Background
The versatile use of reticulated platelets has already been demonstrated in various studies in human medicine and is increasingly gaining importance in veterinary medicine. The ADVIA 120/2120 is capable of determining canine r-PLTs using a fixed gating strategy and flow cytometric data analysis software. Recently, a new method has been introduced for software version v6.11.7 using a moving threshold that has not been evaluated before for dogs.

Objective
The aim of this study was to evaluate the novel method of r-PLT detection using a moving threshold (r-PLTmt) in comparison with flow cytometry as refence method and to provide reference intervals. Moreover, the impact of validation of results by visual inspection of scattergrams was assessed as well as intra-assay coefficient of variation (CV) in samples of low, medium, and high concentrations of r-PLTs and samples with potential interferences with the measurement such as microcytic erythrocytes.

Materials and Methods
Forty-two blood samples were compared with the reference method of flow cytometry using the automated r-PLT method of the ADVIA 120/2120 (r-PLTmt) and a visually validated r-PLT method (r-PLTmtv). The novelty of the automated measurement consists of a moving threshold (mt), which creates an individual adjustment of the gate for the detection of reticulated platelets to the individual platelet counts. The method of visual validation (r-PLTmtv) takes into account the characteristics of canine reticulated platelets, which appear further right in the scattergram and outside the preset gate.
The calculation of the coefficient of variation was assessed in samples with low, medium, and high concentrations of r-PLTs and samples with potential interference with the measurement such as microcytic erythrocytes evaluated. Spearman's rank correlation coefficient, Bland Altman analysis, and Passing-Bablok regression were used for statistical evaluation of the method comparison. Reference intervals for percentage and absolute r-PLTs were established using 120 blood samples from healthy dogs for both the r-PLTmt and the r-PLTmtv method.

Results
The coefficient of variation (CV) for percentage r-PLTs assessed with flow cytometry was 12.9 %. The CVs for percentage and absolute r-PLTs assessed with the automated method were 29.1 % and 29.6 % and for the validated method 22.6 % and 24.3 % for low r-PLT counts. The CVs for percentage and absolute r-PLTs assessed with the automated method were 15.7 % and 14.4 % and assessed with the validated method 12.9 % and 10.9 % for medium r-PLT counts. The CVs for percentage and absolute r-PLTs with the automated method were 20.2 % and 14.8 % and for the validated method 18.3 % and 14.5 % for high r-PLT counts. The coefficients of variation for percentage and absolute r-PLTs by automated method showed values of 65.7 % for %r-PLTmt and 35.8 % for %r-PLTmt and values of 65.0 % for r-PLTmt and 36.7 % r-PLTmt for measurement of a-r-PLT, respectively, for the samples with high interference by microcytic hypochromic erythrocytes. The coefficients of variation for the validated method showed values of 19.8 % for %r-PLTmtv and 13.1 % for %r-PLTmtv and 17.5 % and 14.6 % for a-r-PLTmtv.
Method comparison showed a correlation coefficient of 0.75 for the automated method and 0.76 for the modified method compared to flow cytometry. The mean deviation for %r-PLTmt was -10.76 (range: 42.63) and for %r-PLTmtv -9.68 (range: 39.22). Reference intervals for percentage and absolute r-PLT were 0.2 to 3.8 % and 0.6 to 10.2 x 109/l (r-PLTmt) and 0.3 to 4.5 % and 1.1 to 10.3 x 109/l (r-PLTmtv).

Conclusion
The new r-PLT parameter of the ADVIA 120/2120 showed moderate correlation with flow cytometry for both measurement methods with visual validation showing slightly higher correlation than the standard automated method. Visual validation of scattergrams is particularly recommended for samples with high interference from microcytic, hypochromic erythrocytes. Similarly, inclusion of signals located further right in scattergrams of dogs leads to more precise results. In summary, both measurement methods are suitable for the detection of reticulated platelets. The optimization of the gate towards adaption to characteristics of canine reticulated platelets could offer an entry into routine diagnostics and is therefore desirable.