Morphologiebeeinflussung von Lechevalieria aerocolonigenes und heterologe Produktion von Rebeccamycin

 
Cuvillier Verlag
  • erschienen am 21. März 2017
  • |
  • 152 Seiten
 
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978-3-7369-8502-5 (ISBN)
 
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Optimierung der biotechnologischen Produktion des Sekundärmetaboliten Rebeccamycin u.a. mit Hilfe des filamentös wachsenden Actinomyceten Lechevalieria aerocolonigenes sowie der Aufarbeitung des Produktes. Rebeccamycin bzw. seine Analoga stellen eine interessante Gruppe von Zytostatika dar, die als Topoisomerase-Hemmer wirken und in die DNA-Replikation der Zellen eingreifen und somit Potential als Krebstherapeutika zeigen. Die Optimierung der Rebeccamycinproduktion wurde auf verschiedenen Wegen bewerkstelligt. Einerseits wurde der Ansatz verfolgt, die Produktion durch Beeinflussung der Kultivierungsbedingungen zu verbessern. Hier wurden die Art des Inokulums, Medienzusammensetzung und Zugabe verschiedener Mikro- und Makropartikel getestet und deren Auswirkung auf die Morphologie des filamentös wachsenden Mikroorganismus und seine Produktivität untersucht. In den Untersuchungen konnte ein produktivitätssteigender Einfluss von Mikropartikeln auf L. aerocolonigenes aufgezeigt werden. Der Zusatz von Talkpartikeln (10 g L-1, Ø = 7 µm) führte zu einer 3-fach erhöhten Produktkonzentration im Vergleich zur Kontrolle ohne Mikropartikelzusatz. Weitere Experimente zeigten einen signifikanten Einfluss von Talkpartikeln mit modifizierten Oberflächen (10 g L-1, Ø < 30 µm) und negativem Zeta-Potential auf die Produktivität. Die Produktkonzentrationen konnten um den Faktor 5 gegenüber dem Kontrollansatz mit nicht-modifizierten Talkpartikeln gesteigert werden. Weiterhin wurde auch die mechanische Beeinflussung von verschiedenen Glaskugeln im Millimeterbereich auf Biopellets von L. aerocolonigenes untersucht. Glaskugeln mit einem Durchmesser von 0,5 mm führten zu einer 22-fachen Steigerung der Rebeccamycinproduktion gegenüber der unbeladenen Kontrolle. Durch weitere Erhöhung des Glaskugeldurchmessers erhöhte sich auch die mechanische Beanspruchung auf den Mikroorganismus. Dadurch wurde die vorteilhafte Pelletmorphologie zerstört und die Produktivität signifikant verringert. Die Untersuchungen zeigten deutlich, dass die durch Glaskugeln induzierte mechanische Beanspruchung für eine gewünschte Produktivitätssteigerung nur in einem engen Prozessfenster durchgeführt werden kann. Andererseits wurde zur Produktivitätssteigerung der Ansatz einer heterologen Expression in E. coli verfolgt, mit dem Ziel, die Problematik der Kultivierung von filamentösen Organismen zu umgehen und die Kultivierung durch den weniger anspruchsvollen Organismus zu erleichtern. Verschiedene Klonierungsstrategien wurden angewendet, die erzeugten Klone nach erfolgreichem Einbau der Rebeccamycingene untersucht und in verschiedenen Kultivierungsbedingungen getestet. Eine Produktion von Rebeccamycin konnte nachgewiesen werden, allerdings nur auf einem geringen Niveau. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Promotoren von L. aerocolonigenes nur schlecht in E. coli erkannt werden und wahrscheinlich Ursache für die geringen Produktivitäten sind. Um die Produktaufarbeitung zu erleichtern und eine Alternative für oft toxische Lösungsmittel als Extraktionsmittel für Rebeccamycin und weitere hydrophobe Produkte bereitzustellen, wurde das Fettalkoholpolyglykolether Genapol C 200 als Extraktionsadditiv getestet. Die Zugabe von Polymeren in wässrige Lösungen ermöglichte eine wässrige Extraktion von hydrophoben Substanzen. Es konnte gezeigt werden, dass Genapol C 200 als Extraktionsmittel für verschiedene hydrophobe Produkte nach Abschluss der Kultivierung eingesetzt werden kann und eine wässrige Extraktion ohne Einsatz von Lösungsmitteln mit hoher Effektivität ermöglicht. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Graduierten Kollegs Mikrobielle Naturstoffe (MINAS) durchgeführt und vom Land Niedersachsen gefördert.
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  • 5 Zusammenfassung und Ausblick
  • 6 Symbol- und Abkürzungsverzeichnis
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